棘托竹荪孢子粉抗氧化活性研究

王彦辉，林陈强，邱宏端 ，陈济琛，林新坚*

1福州大学生物科学与工程学院，福州350008;2福建省农科院土壤与肥料研究所，福州350001

竹荪是一种名贵的食用真菌，其营养丰富，香味浓郁，滋味鲜美，历史上列为“宫廷贡品”、“菌中皇后”。现代医学研究证明，竹荪具有滋补强壮、益气补脑、宁神健脑之功效，且含有能抑制肿瘤的成分。竹荪子实体主要可分为三大部分:菌盖、菌体和菌托。菌盖上着生的孢体，约占竹荪子实体干重的12%。竹荪具有抗氧化活性，对其活性成分的研究主要集中在竹荪菌体抗氧化活性。Yang-Lin Hua通过水提、凝胶过滤纯化竹荪多糖，发现其具有较强的体内抗氧化活性［1］。Jeng-Leun Mau等研究了包括竹荪在内的四种特殊食用菌的抗氧化活性，发现竹荪甲醇提取物抗氧化活性最高［2］。庄永亮等发现红托竹荪菌盖多糖具有较强的还原能力和抑制羟基自由基的能力，且随浓度升高抑制羟基自由基的能力相应提高［3］。李波等发现七种云南产食用菌中竹荪的甲醇提取物抗氧化活性较突出，其总酚含量为15.44 mg/g［4］。江玉姬等对26种食用菌子实体水提和醇提液进行了总还原能力、羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除能力测定发现竹荪的综合抗氧化活性较高，且水提活性相比醇提高［5］。然而，对于竹荪孢子抗氧化的作用至今未见报道，本文拟通过其抗氧化的作用研究，提高竹荪资源利用率，研发新产品。

1 材料与仪器

1．1 材料

棘托竹荪(Dictyophora echino-volvata Zane)，2012年6～9月源于福建省顺昌县。

1．2 仪器与设备

紫外可见分光光度计［UV-2800AH型，尤尼柯(上海)仪器有限公司］;电子分析天平(AR1530，美国);超低细菌型超纯水器(SPW-10TJ型，上海赛鸽电子科技有限公司);低速大容量离心机(DL-5型，上海安亭科学仪器厂);旋转蒸发器(R209型，上海申生科技有限公司);循环水多用式真空泵(SHBB95型，郑州长城科工贸有限公司);低温冷却液循环泵(DL1030型，上海申生科技有限公司)。实验所用有机试剂购于国药集团。

2 实验方法

2．1 竹荪孢子收集与破壁竹荪孢子制备

2．1．1 竹荪孢子收集

采集新鲜的竹荪，将菌盖剥离，用纯水洗涤，过滤，5000 rpm离心5 min，将获得孢子烘干，过筛;竹荪破壁孢子粉，由福建省仙芝楼生物公司破壁，破壁率达90%以上。

2．1．2 孢子粉水提液制备

分别精确称取破壁与未破壁竹荪孢子粉1 g于50 mL锥形瓶，料液比1∶30加入超纯水，室温条件下超声震荡10 min后于90℃水浴中浸提3 h，5000 rpm离心5 min，上清转移至50 mL容量瓶中，沉淀按上述步骤再次浸提，离心，合并浓缩，定容至50 mL。

2．1．3 孢子粉醇提液制备

分别精确称取破壁与未破壁的竹荪孢子粉1 g于50 mL锥形瓶，80%乙醇，料液比1∶30，室温条件下超声震荡10 min后于80℃水浴中回流提取3 h，5000 rpm离心5 min上清转移至50 mL容量瓶中，沉淀按上述步骤再次浸提，离心，合并浓缩，定容至50 mL。

2．2 抗氧化活性测定

2．2．1 DPPH自由基清除能力测定

参照Vattem等的方法［6，7］进行。吸取竹荪孢子粉的水提液和醇提液2 mL(初提液稀释10倍)于20 mL比色管中，加入2 mL 60μmol/L DPPH溶液，摇匀，室温避光放置30 min，于517 nm测吸光度(As)，空白对照为2 mL水或醇加2 mL 60μmol/L DPPH溶液(Ao)，以2 mL样品加入2 mL双蒸水或醇作为样品对照(Ax)，消除样品颜色的干扰，阳性对照为抗坏血酸(Vc)。每个样品重复三次取平均值。清除率R按下式计算:

R=［1-(As-Ax)/Ao］×100%

2．2．2 羟基自由基清除能力测定

参照陈留勇的水杨酸法［8］，并略作改动。反应体系中含 2 mL 6 mmol/L H2O2，2 mL 6 mmol/L FeS04，2mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，待测溶液2 mL，H2O2最后加入启动反应。36～37℃水浴反应30 min后，12000 rpm离心6 min，以水为参比在510 nm下测定吸光度，重复三次取平均值(Ax)。空白对照(Ao)为2 mL双蒸水或醇代替待测溶液。以2 mL 6 mmol/L FeS04，2 mL 6 mmol/L 水杨酸-乙醇，2 mL待测溶液和2mL双蒸水或醇作为样品对照消除样品颜色的干扰(Axo)。阳性对照为抗坏血酸(Vc)。清除率R计算公式为:

R=(Ao-(Ax-Axo))/Ao×100%

其中Ao为空白对照吸光度，Ax为加入待测溶液后的吸光度，Axo为待测溶液的本底吸收值。

2．2．3 总还原力测定

总还原力测定参考 Oyaizu(1988)法［9，10］，并略作改进。取样品溶液0．2 mL，加2 mL 0．2 mol/L、pH 6．6磷酸缓冲溶液和2 mL 1%铁氰化钾(K3Fe(CN)6)溶液于1．5 mL离心管中混匀。50℃水浴20 min，加2 mL 0．4 mol/L 三氯乙酸溶液，5000 r/min离心10 min，取上清液2 mL加2 mL蒸馏水和0．4 mL 0．02%三氯化铁(FeC13)溶液，混合均匀，室温下反应10 min，700 nm下检测吸光度。三次重复取平均值，阳性对照为抗坏血酸(Vc)。

2．2．4 超氧阴离子自由基清除能力测定

根据张志军的方法［11］，3 mL pH 8．2 Tris-HCl缓冲液和1 mL待测样品，25℃水浴20 min后加入3 mL 7 mmol/L的邻苯三酚，反应4 min后加10 mol/L HCl终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，在420 nm处测吸光度，三次重复取平均值，对照组(Ao)以蒸馏水或醇代替，空白组(Axo)为不加邻苯三酚，阳性对照为抗坏血酸(Vc)。

清除率R=(Ao-(Ax-Axo))/Ao×100%

其中Ao为空白对照吸光度，Ax为加入待测溶液后的吸光度，Axo为待测溶液的本底吸收值。

2．2．5 对Fe2+的螯合能力测定

参考 Decker等的方法［12，13］并作适当修改，移取1 mL样品，加2．5 mL提取溶剂混匀，各加0．1 mL 2 mmol/L FeCl2溶液充分混匀，加0．2 mL 5 mmol/L Ferrozine溶液混匀反应10 min，在波长562 nm处测定其吸光度，重复三次取平均值，以1mL双蒸水或醇代替样品作为对照组(Ao)，空白组(Axo)不加FeCl2，EDTA-Na2为阳性对照。

螯合力R=(Ao-(Ax-Axo))/Ao×100%

其中Ao为空白对照吸光度，Ax为加入待测溶液后的吸光度，Axo为待测溶液的本底吸收值。

2．3 粗多糖含量测定

参考NY/T1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定。

2．4 总多酚含量测定［14］

分别移取没食子酸标准液(20、40、60、80、100 μg/mL)、水、待测提取液各1 mL于20 mL比色管中，在每个试管中内分别加入5．0mL 10%福林酚试剂，摇匀，反应5 ～8 min，加入4．0 mL 7．5%Na2CO3溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下放置60 min，765 nm下测定吸光度。以没食子酸标准液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

2．5 总黄酮含量测定

分别吸取 0、2、4、6、8、10 mL 芦丁标准液(0．1 mg/mL)及10 mL待测提取液于25 mL容量瓶中，加水至10 mL，加入5%亚硝酸钠1 mL摇匀后静置6 min，加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀后静置6 min，再加入1 mol/L NaOH溶液10 mL，用60%的乙醇溶液定容至25 mL，静置12 min后，在510 nm处测定其吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。

2．6 不同萃取溶剂对破壁竹荪孢子粉提取物抗氧化活性影响

竹荪孢子粉水提液分别用石油醚、正丁醇、氯仿和甲醇萃取，合并减压浓缩定容至50 mL，DPPH法检测抗氧化活性。

2．7 破壁竹荪孢子粉粗多糖的提取及抗氧化活性测定

称取破壁竹荪孢子粉，料液比1∶30，90℃水浴浸提3 h，5000 rpm离心5 min，沉淀再次浸提，合并减压浓缩后加入三倍体积的95%乙醇溶液，4℃过夜，5000 rpm离心5 min取沉淀，真空冷冻干燥至恒重即为竹荪孢子粗多糖。配制不同浓度的粗多糖溶液，DPPH法检测抗氧化活性。

3 结果与分析

3．1 竹荪孢子粉抗氧化能力

3．1．1 竹荪孢子粉提取物对DPPH自由基清除能力

竹荪孢子粉提取物稀释10倍，对DPPH自由基清除力见图1。由图可知，DPPH的清除能力破壁-醇提(PC)＞破壁-水提(PH)＞未破壁-醇提(WH)＞未破壁-水提(WC)，对数据进行多重比较(P＜0.05)，结果表明，竹荪孢子粉乙醇提取物对DPPH自由基清除能力与水提物之间无显著性差异，破壁处理后的提取物(PC、PH)与未破壁处理(WH、WC)有显著性差异，其中破壁-醇提(PC)清除能力可达75．56%，抗坏血酸(VC)当量为 583．3 μg/g。未破壁醇提提物DPPH自由基清除效果相比水提物有显著性差异，说明破壁处理的竹荪孢子粉更有利于DPPH抗氧化活性物质的提取，且竹荪孢子粉水溶性和脂溶性的活性物质都具有较强的DPPH自由基清除效果。

3．1．2 羟基自由基清除能力

如图2所示，竹荪孢子粉对羟基自由基的清除力:破壁-醇提(PC)＞未破壁-醇提(WC)＞破壁-水提(PH)＞未破壁-水提(WH)，破壁-醇提(PC)的清除率可达54．36%，抗坏血酸(VC)当量为11．87 mg/g。可见，无论是醇提还是水提，破壁竹荪孢子粉羟基自由基清除效果显著高于未破壁样品，醇提效果明显高于水提，表明孢子粉中脂溶性的活性物质对羟基自由基的清除效果更强。

3．1．3 总还原力

采用铁氰化钾法测定竹荪孢子粉提取物还原力结果如图3所示，竹荪孢子粉粗提液的总还原力:破壁-水提(PH)＞破壁-醇提(PC)＞未破壁-水提(WH)＞未破壁-醇提(WC)，可以看出，竹荪孢子粉提取液的总还原力水提液比醇提液高，可能是水提液有还原糖的存在，破壁-水提(PH)的总还原力为1．090，抗坏血酸(VC)当量为 2．701 mg/g。破壁孢子粉与未破壁孢子粉相比具有较强的还原力。

3．1．4 超氧阴离子自由基清除能力

竹荪孢子粉提取物对超氧阴离子的清除能力如图4所示。清除力依次为破壁-水提(PH)＞破壁-醇提(PC)＞未破壁-水提(WH)＞未破壁-醇提(WC)，由图看出，破壁孢子粉水提和醇提对超氧阴离子自由基的清除率都可以达到80%以上，其中破壁-水提(PH)清除率为88．10%，VC当量为 23．43 mg/g。竹荪孢子粉的多糖等水溶性成分对超氧自由基清除率与醇提脂溶性物质对超氧阴离子自由基清除能力都较强，水提相比醇提有显著性差异;破壁与未破壁的相比，破壁竹荪孢子粉无论醇提还是水提对超氧自由基的清除效果都显著高于未破壁孢子粉，可能由于破壁样品有利于竹荪孢子超氧阴离子清除物质的提取。

3．1．5 Fe2+的螯合力

如图5所示，Fe2+的螯合力大小依次为破壁-醇提(PC)＞未破壁-醇提(WC)＞破壁-水提(PH)＞未破壁-水提(WH)，水提液对Fe2+的螯合力较低，醇提液的效果较好，其中破壁-醇提(PC)螯合力为68．10%，EDTA-Na2当量为 2．105 mg/g。可见竹荪孢子粉脂溶性成分更容易与Fe2+螯合阻止Fenton反应的发生。

3．2 竹荪孢子粉粗多糖含量

竹荪孢子抗氧化活性物质除小分子物质外，粗多糖也具有抗氧化活性。采用国标的方法测定竹荪孢子粗多糖含量，结果表明，破壁竹荪孢子粉的多糖含量为8．61 g/100 g，未破壁竹荪孢子的粗多糖含量为5．66 g/100 g，破壁竹荪孢子能提高粗多糖含量。

3．3 竹荪孢子粉总多酚含量

以没食子酸为阳性对照，得回归方程 y=0.0047x+0．0141(r=0．9991)，说明没食子酸浓度在20～100μg/mL时线性关系良好。根据标曲换算样品多酚含量，由表1可知，通过福林酚的方法测定，不同的处理不同的提取方法，多酚的含量也不相同，其多酚含量破壁-水提(PH)＞未破壁-水提(WH)＞破壁-醇提(PC)＞未破壁-醇提(WC)，其中破壁-水提(PH)总多酚含量为5．531 mg/g为最高。

3．4 竹荪孢子粉总黄酮含量测定

本实验采用芦丁为对照品，以芦丁浓度为横坐标，510 nm处吸光值为纵坐标，得回归方程y=0.5257x+0．0041(r=0．9997)，根据回归方程计算样品总黄酮含量。由表1可以看出，竹荪孢子粉的黄酮含量破壁-水提(PH)＞破壁-醇提(PC)＞未破壁-水提(WH)＞未破壁-醇提(WC)，其中水提(PH)优于醇提(PC)，破壁高于未破壁，破壁-水提黄酮含量为3．271 mg/g。

表1 竹荪孢子粉总多酚与总黄酮含量Table 1 Total polyphenols and flavonoids of D．echinovolvata spore

3．5 不同萃取溶剂对破壁竹荪孢子粉提取物抗氧化活性的影响

分别用石油醚、正丁醇、氯仿和甲醇对水提浸膏进行萃取，DPPH自由基清除率检测抗氧化活性，结果发现，如图6所示，四种有机溶剂萃取中甲醇萃取对DPPH自由基清除率最大，为63．10%，其次为正丁醇、氯仿，石油醚DPPH清除率为1．59%。与水提相比，甲醇萃取液的抗氧化活性下降15%，说明破壁竹荪孢子粉水提液中可能存在抗氧化活性多糖等一些水溶性活性物质。相同浓度条件下，不同极性有机溶剂萃取中正丁醇相抗氧化活性相对较强，可作为竹荪孢子粉小分子抗氧化活性物质分离纯化的萃取溶剂。

3．6 破壁竹荪孢子粉粗多糖抗氧化活性

通过水提醇提的方法得到竹荪孢子粉粗多糖，分别配制 0．1、0．2、0．3、0．4、0．5 mg/mL 粗多糖溶液进行DPPH自由基清除力抗氧化活性检测，发现如图7所示，粗多糖0．1 mg/mL时对DPPH自由基清除力为30．86%，随着竹荪孢子粉粗多糖浓度的增大，DPPH自由基清除力也逐渐增大，0．5 mg/mL时DPPH自由基清除力可达83．66%，说明竹荪孢子粉粗多糖具有较好的DPPH清除效果。

4 结论

本研究采用DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、还原力、超氧自由基清除率和对Fe2+的螯合力对竹荪孢子粉的抗氧化效果进行评价。实验结果发现，五种模型对不同处理不同提取方法的评价效果不同。通过统计分析，除DPPH自由基外，破壁样品水提和醇提对超氧自由基清除率、羟基自由基清除率、Fe2+的螯合力及还原力有显著差异，破壁处理后的竹荪孢子粉与未破壁的竹荪孢子粉相比具有较显著的抗氧化活性，说明破壁竹荪孢子粉更有利于活性物质的提取。针对竹荪孢子粉的抗氧化活性，初步检测了与抗氧化可能有关的活性成分，其中破壁-水提样品粗多糖含量可达8．61 g/100 g，总多酚含量 5．531 mg/g，总黄酮含量 3．271 mg/g。

采用不同极性的有机溶剂对破壁竹荪水提液进行浸提发现，甲醇的DPPH自由基清除效果最好，但相对水提液的DPPH自由基清除率下降15%，据此推断竹荪孢子粉还存在其他水溶性的抗氧化活性物质，并通过竹荪孢子粉粗多糖的提取及DPPH自由基清除率的测定，发现竹荪孢子粉粗多糖确实有较强的抗氧化活性，且随着竹荪孢子粗多糖浓度的增大，其DPPH自由基清除率也相应增大。相同浓度条件下，不同极性有机溶剂萃取液中正丁醇对竹荪孢子粉水提浸膏萃取效率最高。

本论文初步研究了竹荪孢子粉的抗氧化活性，为竹荪资源合理利用、竹荪新产品开发及提高农产品附加值提供依据。

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