不同浓度头孢他啶对腹膜透析管大肠杆菌生物被膜的干预作用▲

李艳林 邹龙涛 王成玉 伍巧源 廖蕴华

(广西医科大学第一附属医院肾内科，南宁市 530021)

腹膜透析难治性腹膜炎成为腹膜透析患者退出腹膜透析治疗的主要原因。腹膜炎的反复发生及久治不愈与细菌生物被膜(bi of ilm，BF)的形成有关［1］。细菌BF是指细菌为了适应周围生存环境而形成的一种与浮游细菌相对应的存在方式，由细菌及其分泌的胞外多聚物组成，具有抵抗力强、耐药性强等特点，其引发的感染常需要拔除移植物。本实验以腹膜透析管为载体，采用透析后无菌腹透液为培养液，模拟临床腹膜透析环境建立大肠杆菌(E.coli)BF，并研究不同浓度头孢他啶对E.coli BF的影响，从而给临床腹膜透析BF相关感染的防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料 菌株:临床分离E.coli(经VITEK2 Systerms Version 04.02 鉴定)，编号为0407611754525610，质控菌为ATCC25922，均由广西医科大学微生物教研室提供。载体:腹膜透析管(硅胶，美国百特公司生产)制成1cm长，经高压灭菌后备用。培养液:因慢性肾小球肾炎导致尿毒症患者行持续性不卧床腹膜透析后的无菌腹膜透析液(1.5%腹透液，由美国百特公司生产)，留取隔夜留腹10h的腹膜透析液，每袋均行腹膜透析液常规、生化及细菌培养检查，均证实无污染，经无菌操作将腹膜透析液用无菌瓶分装，－20℃保存，1个月内使用。实验试剂和器材:刚果红(中国远航试剂厂，批号11901)，脑心浸出液肉汤BHI(北京陆桥技术有限责任公司，批号1110262)，2.5%戊二醛、氯化钙、硝酸银、硫代硫酸钠、对苯二酚，普通光学显微镜(BH22，日本OLYMPAS)。抗菌药物:头孢他啶(葛兰素史克，批号K803)。

1.2 方法

1.2.1 刚果红法鉴定 BF菌株 按照 Mrinalini等［2］文献的方法，从－80℃冰箱中取出临床分离的E.coli，用无菌接种环将其复苏于LB琼脂平板上，置于37℃恒温箱，培养20h。挑取其中一个菌落接种于刚果红平板上，置于37℃恒温箱，培养18 h;之后置于室温72 h，观察菌落生长情况。以上实验均独立重复3次。若细菌菌落变黑，菌落周边培养基褪色，则该菌株为BF形成菌株，原因为刚果红染料与BF的多糖胞间黏附素结合，使得产多糖胞间黏附素的菌株形成黑色菌落;若细菌菌株仍为红色，则该菌株为非BF形成菌株。

1.2.2 抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定 根据临床实验室标准化协会(NCCLS)所制定的方法测定头孢他啶的MIC和MBC。

1.2.3 细菌 BF模型的建立 按文献方法［3］:取出在－80℃保存的菌种，复苏后，接种于40mL LB肉汤中，37℃，隔夜培养。次日清晨离心，4℃、10000rpm、10min，沉淀物用无菌生理盐水洗涤2次。然后用培养液调悬液浓度为0.5麦氏单位(细菌数约为5×107－8CFU/Ml)，24孔板各孔加入上述液2mL，每孔置入无菌腹膜透析管载体1个，37℃恒温培养，隔天换液。通过扫描电镜鉴定，7d形成成熟BF。

1.2.4 药物作用后BF的变化 根据实验室标准化协会(NCCLS)所制定的方法，测得头孢他啶的MIC为0.5mg/L，MBC为8mg/L，即为实验所用药物浓度。按上述方法建模7d后加入实验用药，分为空白对照组(即加等量灭菌生理盐水)、低浓度组(1×MIC)、高浓度组(1×MBC)共3组。作用12h后，取出腹膜透析管载体，用无菌生理盐水冲洗载体表面浮游菌，各组分别取4份腹膜透析管载体行连续稀释涂板细菌菌落计数［3］，另外各组分别取两份行银染法染色［4］后，显微镜观察BF药物作用前后的变化情况。以上实验独立重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 刚果红法鉴定BF形成菌株 对照组E.coli菌株仍为红色，该菌株为非BF形成菌株。临床分离的E.coli菌落变黑，菌落周边培养基褪色，该菌板株为BF形成菌株。详见图1。

图1 刚果红法鉴定BF形成菌株

2.2 抗菌药物MIC和MBC的测定 实验测得头孢他啶的MIC为0.5mg/L，MBC为8mg/L。

2.3 扫描电镜观察成熟E.coli BF的建立建模7d后，取腹膜透析管载体行扫描电镜观察，可见载体表面形成大片块状、致密的具有立体结构的膜样物，即形成成熟的E.coli BF。见图2。

图2 建模7d扫描电镜观察载体表面BF(×7000)

2.4 不同浓度头孢他啶作用后E.coli BF的变化情况

2.4.1 连续稀释涂板细菌菌落计数(×105CFU/L)低浓度组(122.25±10.51)与对照组(132.17±14.12)比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。高浓度组(15.28±3.88)与对照组、低浓度组比较，差异均有统计学意义(均P＜0.01)。

2.4.2 银染法显微镜观察不同浓度头孢他啶作用后E.coli BF的变化 银染后普通光学显微镜观察，空白腹膜透析管载体表面无棉絮样、黑色团块状物，即无BF形成(见图3A);对照组载体表面上可见大量的棉絮样、黑色团块状物，即大量的BF(见图3B);低浓度组载体表面仍见大量棉絮样、黑色团块状物，与对照组比较BF量无明显改变(见图3C);高浓度组载体表面上可见棉絮样、黑色团块状物明显减少，表明高浓度头孢他啶作用后BF明显减少(见图3D)。

图3 银染后显微镜观察载体表面BF的情况(×400)

3 讨 论

随着医学科技的发展，生物材料的应用逐渐增多，由此引发的相关感染发生率逐年上升［5］。腹膜透析是尿毒症患者替代治疗的方法之一，腹膜透析管的植入，为腹膜透析BF相关感染提供了条件。其中E.coli是腹膜透析相关性腹膜炎G－菌感染最常见的病原菌之一。腹膜透析相关性腹膜炎的经典治疗处方为头孢唑林和头孢他啶的联合配伍［6］。目前尚未见头孢他啶对腹膜透析BF相关感染的研究。本实验以腹膜透析管为载体，患者透析后无菌的腹膜透析液为培养液，更合理的模拟临床腹膜透析BF相关感染的环境，且建模7 d形成成熟的E.coli BF的模型。目前大多BF药物作用的研究多采用作用24 h后观察BF的变化，临床腹膜透析相关腹膜炎患者腹腔使用抗生素，该腹膜透析液留腹时间多为10～12 h，故本实验采用药物作用12 h后观察BF的变化。

本课题组前期实验［7］已证实银染法后用普通光镜观察BF变化的情况与用扫描电镜观察的结果一致。而银染法操作简单，价格低廉，故本实验主要采用银染法及连续稀释涂板细菌菌落计数法观察不同浓度头孢他啶对E.coli BF的作用。结果显示低浓度(1×MIC)头孢他啶作用成熟E.coli BF后BF内活菌数与对照组比较差异无统计学意义，载体表面仍见大量棉絮样、黑色团块状物，表明低浓度头孢他啶对E.coli BF作用不明显;而高浓度(1×MBC)头孢他啶作用后BF内活菌数与对照组、低浓度组比较差异均有统计学意义，载体表面上棉絮样、黑色团块状物明显减少，表明高浓度头孢他啶能显著减少E.coli BF内活菌数，且能破坏BF，但未完全清除。由此可以推测临床腹膜透析E.coli BF引起的相关感染，单用高浓度的头孢他啶能破坏BF，但不能彻底清除。另外，目前抗生素对BF的相关研究多采用抗生素对细菌的MIC或其若干倍，较少使用MBC。本实验表明，对于BF的研究采用抗生素对细菌的MBC效果会更好。

目前腹膜透析相关性难治性腹膜炎已成为临床医师面临的棘手问题，其与细菌BF的形成关系密切。本研究为临床腹膜透析BF相关感染的的治疗提供了一定的参考价值。

［1］Patel R.Bi of ilms and antimicrobial resistance［J］.Clin Orthop Related Res，2005，(437):41－47.

［2］Mrinalini S，Livia V，Francesca B，et al.Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal bi of ilms［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2008，52(1):299－305.

［3］王成玉，梁 俐，伍巧源，等.在腹膜透析液及LB液环境中腹膜透析留置大肠杆菌生物被膜形成能力的对比［J］.内科，2011，6(5):397－399.

［4］Passariello C，Berlutti F，Selan L，et al.A rapid staining procedure to demonstrate glycocalyx production and bacterial bi of ilms［J］.The New Microbiological，1994，17(3):225－230.

［5］Borriello G，Richards L，Ehrlich GD，et al.Arginine or nitrate enhances antibiotic susceptibility ofPseudomonas aeruginosain bi of ilms［J］.Antimicrob Agents Chemotherapy，2006，50(1):382－384.

［6］韩庆烽，汪 涛.腹膜透析相关性腹膜炎［J］.中国血液净化，2007，6(12):642－644.

［7］梁 俐，王成玉，邹龙涛，等.银染法观察大肠杆菌生物被膜变化的初探［J］.内科，2012，7(2):95－97.