高密度二氧化碳对牛背最长肌颜色稳定性的影响

张巧娜，杨红菊，高晓光，戴瑞彤，*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.中国动物疫病预防控制中心，北京100107）

高密度二氧化碳技术（DensePhaseCarbonDioxide，DPCD）的基本原理是在一定的温度、压力和时间条件下，给予处于密闭处理釜的物料高压CO2处理，形成高压、高酸环境，从而杀死物料中的微生物、钝化内源酶[1]，达到延长贮藏期和改良物料品质的目的。

近些年来，DPCD作为一种新型冷杀菌技术备受青睐，很多研究结果也证实了DPCD具有显著的杀菌效果，但是处理对肉的色泽造成了不利的影响[2]。肉的色泽主要与肌红蛋白（Mb）有关，Mb有三种化学存在形式：还原型肌红蛋白（DeoMb，暗紫色）、氧合型肌红蛋白（OxyMb，鲜红色）和高铁型肌红蛋白（MetMb，棕褐色）。在一定的条件下，这三种形式的Mb在一定条件下可以相互转化。姚中峰等[3]研究DPCD处理能使肉由红色逐渐变成灰棕色，显著提高L*值（p＜0.05）、降低a*值（p＜0.01），并且4℃冷藏7d后，与对照组相比，DPCD处理能提高肌红蛋白的稳定性。在贮藏期间，MetMb会逐渐积累，肉色变褐，由于屠宰后肉内存在的各种酶系还没有失活，肌肉内还在进行着一系列生理生化的反应，这些都会影响肉品色泽及Mb的含量与状态。戴瑞彤[4]通过对MetMb还原酶与冷却肉色泽稳定性之间的关系研究发现，肌肉中MRA越高，肉的色泽越稳定。有文献[5]报道线粒体活性高，呼吸耗氧上升，进而降低了氧分压，促使OxyMb脱氧形成DeoMb，DeoMb稳定性差，更易被氧化成MetMb，使肉色变褐，影响了肉的颜色稳定性。本文通过研究DPCD处理对Mb、MRA、线粒体呼吸及相关其酶系活性等指标的影响，旨在探究经DPCD处理后这些指标的变化与颜色稳定性的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

屠宰后经24h冷却的牛背最长肌 北京御香苑公司；马心肌红蛋白、琥珀酸、还原型辅酶I（NADH）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、2，6-二氯酚靛酚（DCPIP）

美国Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA） 拜尔迪生物有限公司；蔗糖、Tris-Base、乙二胺四乙酸（EDTA）等 北京蓝弋试剂公司，均为分析纯；CO2气体（纯度99.9%） 北京分析仪器公司。

WBN-5/50型高密度二氧化碳杀菌器 温州贝诺机械有限公司；FA25型均质机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；TGL20M型台式高速冷冻离心机 盐城市凯特实验仪器有限公司；CR400型色差仪 日本柯尼卡－美能达公司；Evolution 60S型紫外可见分光光度计 Thermo Fisher；OXYGRAPH型液相氧电极 英国汉莎（Hansatech）公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DPCD处理 开机预热DPCD设备30min，开启风箱使得冷冻机组冷却水箱温度降低到-5℃左右，每次实验前在操作控制面板上分别设定处理压力（7、14、21、28、35MPa），开启恒温水浴循环系统，处理釜温度升温至25℃并保持稳定。

取屠宰后经24h冷却的背最长肌。在无菌操作条件下，去掉牛背最长肌的筋膜及可见的脂肪，切成5cm×3cm×1cm的肉片，摆在镂空肉架上置于处理釜中，密封后泵入CO2，经过5～10min的升压过程达到设定压力，保持恒压20min。处理时间达到后，取出样品，真空包装后放于0～4℃冰箱备用。

1.2.2 色泽的测定 取肉样，用手持色差仪直接测量色泽，每组样品选取5～8个点进行测量。

1.2.3 肌红蛋白含量的测定 采用Tang[6]的方法，用分光光度计法进行MetMb相对百分含量的测定。

1.2.4 高铁肌红蛋白还原酶活性（MRA）的测定

1.2.4.1 样品中MetMb还原酶粗酶液的提取 高铁肌红蛋白还原酶活力的测定，按照Mikkelsen的方法[7]，稍有改动。取肉样10g加入20mL 4℃磷酸盐缓冲液（2.0mmol/L，pH7.0），4℃下均质1min，均质液在4℃下，10000r/min离心20min，上清液经滤纸过滤除去脂肪，滤液中OxyMb用稍过量的高铁氰化钾氧化后，再用冰的磷酸盐缓冲液（2.0mmol/L，pH7.0），4℃下透析24h，期间换液三次，透析完毕后，12000r/min离心20min（4℃），取上清液作为MetMb还原酶粗酶液。

1.2.4.2 MRA的测定 还原酶的活性用分光光度法测定。配制标准反应混合物，成分见表1（pH6.4，温度为25℃），空白对照以水代替NADH，其他组分不变。反应由加入NADH起始，用紫外可见分光光度计记录波长580nm的吸光值。依照Mikkelsen的方法[7]，MetMb还原酶的活性用每毫升提取液在1min内580nm下吸光值变化来表示。在此波长下OxyMb与MetMb的吸光值相差最大，两者的摩尔消光系数为12×103L·mol-1·cm-1。通过反应前后（在反应线性阶段）光吸收值的变化，便可计算出MRA活性。每个样品重复三次，取平均值。

表1 高铁肌红蛋白还原酶活力测定的标准反应混合物Fig.1 Reaction substances of metmyoglobin reductase activity

1.2.5 线粒体的提取 线粒体的提取参考Zhu[8]的方法。

1.2.6 琥珀酸脱氢酶（SDH）活力的测定 参照文献[9]的方法，配制标准反应物，成分如表2所示，反应温度为25℃，对照组以去离子水代替琥珀酸钠溶液，其他组分不变。用去离子水校零，测定反应溶液在600nm处的吸光值。加完反应溶液，立即混合均匀并开始计时，持续记录5min的A600，以获得适当的反应速率。每个样品的酶活力测定重复三次，取平均值。SDH活力的计算公式如下：

SDH活性单位：1U=A600/min=ΔA600/（Δt×0.01）

SDH的比活力[U/（mg蛋白质·min）]=ΔA600/（Δt×0.01）/蛋白质浓度（mg/mL）/0.2×3.0

式中，ΔA600：反应直线段吸光值的改变量；Δt：直线段反应时间（min）。

表2 琥珀酸脱氢酶活力测定的反应物组分Fig.2 Reaction substances of succinic dehydrogenase activity

1.2.7 耗氧率（OCR）的测定 耗氧率的测定依据Kaplan的方法[10]，稍有改动。首先分别在4℃和25℃校正氧电极，用高浓度、现用现配的连二亚硫酸钠校正零氧线，然后用去离子水清洗反应室12次以上。再用OC缓冲液（70mmol/L蔗糖、0.002mmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl、5mmol/L K2HPO4，pH7.4）冲洗几次，向反应室中加入1mL OC缓冲液，盖好反应室盖子。开启转子，开始记录氧含量，等待2min使氧含量平稳。取肉样5g绞碎混匀在50mL去离子水中，测试时加入1mL肉样液加入反应室，立即计时，记录5min内的呼吸速率，即为肉的OCR（nmol/（g meat·min）。

1.2.8 统计分析 采用SPSS 17.0数据分析软件进行单因素方差分析（ANOVA）分析；数据结果以平均值±标准差进行记录，显著性水平p＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 DPCD处理对色泽的影响

从表3中看出，随着压力的升高，L*值大体呈上升趋势，原因可能是压力的升高，一方面使肉表面纤维结构更疏松、汁液溶出量增加；另一方面高压使CO2扩散进入肉中后，与水结合形成H2CO3并部分水解成H+和HCO3-，使肉的pH降低，蛋白质发生变性和凝集程度增加，肉的保水性下降进而造成更多的水分损失，损失的水分附着在肉的表面使肉的亮度值增加[11]。DPCD处理对a*值有显著影响（表4），随着压力的升高，a*值呈下降趋势，Choi等[2]认为a*下降的原因是肌浆蛋白中的蛋白变性对肉的红度起到遮掩作用，因此影响了肉的红度值和亮度值。随着贮藏时间的延长，L*值上升，a*值下降，可能是由高铁肌红蛋白的积累所导致。对照组中L*值和a*值变化的幅度显著大于处理组，可以得出DPCD处理保持了L*和a*的稳定性。DPCD处理虽对牛肉的色泽造成了影响，但却提高了牛肉在贮藏期间的颜色稳定性。

2.2 DPCD处理对肌红蛋白含量的影响

由表5～表7可知，随着压力的升高，DeoMb和OxyMb的含量下降，MetMb的含量上升，原因可能是随着压力的升高，CO2浓度升高，排出的O2越多，造成氧分压降低。低氧分压会导致Mb部分变性，从而使其失去保护血红素的生理功能[12]，失去了保护的Fe2+就会自动氧化成Fe3+，生成褐色的MetMb。MetMb含量与a*成负相关性，这与Carlez等的研究结果是一致的[13]。在贮藏期间，可以明显的看出处理组尤其是压力高的处理组中的三种形式Mb含量的变化速度显著低于对照组，从而可以得出DPCD处理使DeoMb、MbO2和MetMb的含量相对趋于稳定，说明DPCD处理过程中CO2压力的提高能增大肌红蛋白三种氧化还原状态的稳定性，从而也增大了牛肉色泽的稳定性。

表3 DPCD处理对牛肉及贮藏期间亮度值L*值的影响Table 3 Effect of DPCD treatment on L*value of chilled beef during storage

表4 DPCD处理对牛肉及贮藏期间红度值a*值的影响Table 4 Effect of DPCD treatment on a*value of chilled beef during storage

表5 DPCD处理对牛肉及贮藏期间DeoMb含量百分比的影响（%）Table 5 Effect of DPCD treatment on DeoMb content percentage of chilled beef during storage（%）

表6 DPCD处理对牛肉及贮藏期间OxyMb含量百分比的影响（%）Table 6 Effect of DPCD treatment on OxyMb content percentage of chilled beef during storage

表7 DPCD处理对牛肉及贮藏期间MetMb含量的影响（%）Table 7 Effect of DPCD treatment on MetMb content percentage of chilled beef during storage（%）

表8 DPCD处理对牛肉及贮藏期间MetMb还原酶活性的影响（nmolMMb reduced/min）Table 8 Effect of DPCD treatment on MetMb reductase activity of chilled beef during storage（nmolMMb reduced/min）

表9 DPCD处理对牛肉及贮藏期间琥珀酸脱氢酶活性的影响（U/（mg pro·min））Table 9Effect of DPCD treatment on succinate dehydrogenase activity of chilled beef during storage（U/（mg pro·min））

2.3 DPCD处理对MRA活性的影响

由表8看出，随着压力的升高，MRA活性下降。但是7MPa处理组与对照组并没有显著差异，而当压力大于14MPa的各处理组，与对照组相比酶活性显著降低（p＜0.05），这可能是由于肉的pH较低所致，Zhu等[14]报道pH显著影响MetMb的还原作用，尤其是当pH＜6时，低pH降低了MRA的还原能力。随着时间的延长，MRA逐渐降低。有文献报道，MetMb还原酶在冷藏的一定阶段对肉色的稳定性起主导作用，在冷藏的前3d，肉色可能主要由氧分压、OCR及MetMb还原酶等联合控制；在第3～7d，MetMb还原酶起主导作用[15]。

2.4 DPCD处理对SDH活性的影响

SDH是反映线粒体功能的标志酶之一，其活性一般可作为评价线粒体活性的指标。由表9看出，随着压力的升高，SDH的活性降低。原因可能有：一方面，随着压力的增大，肉的pH下降，低pH影响线粒体的结构和活性；另一方面，压力对线粒体结构造成一定的物理性伤害。许多学者[16-17]都提出了低pH是造成线粒体结构完整性和功能性下降的主要原因。本实验中，随着贮藏时间的延长，对照组和处理组线粒体的活性都呈下降的趋势，Tang[18]研究了牛心肌线粒体的完整性和活性，在电镜下观察发现宰后2h线粒体保持结构的完整；96h后，大多出现碎片，大液泡使线粒体肿大，形态不再完整。在本实验中，对照组中牛肉的色泽稳定性低于处理组，表8中的数据正好支持了色泽稳定性差的而线粒体活性高的结论。

2.5 DPCD处理对OCR的影响

由表10可以看出，随着压力的升高，耗氧率下降。随着贮藏时间的延长，对照组和处理组的耗氧率都呈下降的趋势，这与Lanari[19]在文献中的报道是一致的：在贮藏期间，耗氧率随时间的变化是显著的（p＜0.05）。经过DPCD处理的牛肉在贮藏期间颜色稳定性好于对照组，其耗氧率低于对照组，即呼吸强度高的肉颜色稳定性差。O’Keeffe等[20]得出OCR与MetMb的积累速度呈显著正相关；线粒体活性高，呼吸耗氧上升，进而降低了氧分压，促使OxyMb脱氧形成DeoMb，DeoMb稳定性差，更易被氧化成MetMb，使肉色变褐，进而缩短了肉的颜色货架期[5]。

表10 DPCD处理对牛肉及贮藏期间耗氧率的影响（nmol/（g meat·min））Table 10Effect of DPCD treatment on oxygen consumption rate of chilled beef during storage（nmol/（g meat·min））

3 结论

本实验研究了DPCD处理对牛肉的颜色稳定性的影响。随着压力的提高，a*、OxyMb含量、高铁肌红蛋白还原酶活、琥珀酸脱氢酶活、耗氧率降低，L*、MetMb含量升高。可见DPCD处理对牛肉的色泽造成了不利的影响，使肉红度值降低，但是DPCD处理却提高了牛肉在贮藏期间的颜色稳定性。因此若想在肉品工业生产中推广这一技术，降低DPCD处理对肉色的影响，需要采取护色技术，防止其对颜色的不利影响。

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