亚临界丙酮提取万寿菊渣中抗氧化活性成分的研究

李禹辰，王 迪，樊 蕊，高彦祥，袁 芳

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

万寿菊为菊科万寿菊属一年生草本植物，花色鲜艳，具有很好的观赏价值。万寿菊花瓣中富含具有药用与保健功能的叶黄素。经过发酵、制粒、萃取等生产加工过程提取叶黄素后剩余的大量残渣，目前常被用作肥料使用，其中的功能成分并没有得到充分的重视和利用。研究表明，黄酮和多酚类物质均为性能较好的抗氧化剂，可有效清除体内的氧自由基，具有抗肿瘤、抗菌、抗衰老等功效[1-2]。亚临界流体萃取是继超临界流体萃取技术之后诞生的新型分离技术，萃取压力较低，可工业化大规模生产，具有节能、运行成本低等优点[3]。其原理是在适当压力下，溶剂仍然保持液体状态，但与常温常压时相比，极性发生变化，从而可以选择性地提取不同种类的植物有效成分[4-5]。从萃取效果看，植物活性成分得到了很好的保护[6]。本实验研究不同丙酮浓度、提取温度、时间、液固比条件下亚临界丙酮对万寿菊渣中抗氧化活性成分提取效果的影响，并采用ABTS+·、DPPH·清除法对提取液的抗氧化活性进行评价。研究结果对万寿菊的综合利用，进一步开拓亚临界萃取技术在食品领域的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

万寿菊颗粒（已脱脂） 山东赛特天然香精有限公司；没食子酸标品（98%HPLC）、芦丁标品（98%HPLC）、Folin-ciocalteu’s试剂（2mol/L）、ABTS+·（2，2-Azinobis-（3-ethylbenzothiazolin-6-sulfoni acid））、DPPH·（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl） Sigma公司；无水丙酮、碳酸钠、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠、过硫酸钾、无水甲醇 分析纯，北京化学试剂公司。

CWYF-2型亚临界水萃取装置 江苏华安石油科研仪器设备有限公司，如图1所示；UV-1800型紫外可见分光光度计 日本岛津公司；DSHZ-300型恒温水浴振荡器 江苏太仓市实验设备厂；TDL-5-A型台式离心机 上海安亭科技仪器厂；HY-200型中草药连续式粉碎机 北京鑫环亚科技有限公司。

图1 亚临界流体萃取装置Fig.1 Subcritical fluid extractor

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮含量（total flavonoid content，TFC）的测定 参照文献[7]略作修改。将适当稀释的样品0.5mL、3.5mL去离子水和0.3mL的5%（w/v）亚硝酸水溶液加入到10mL的刻度试管混匀，反应5min，加入3mL的1%氯化铝水溶液，反应6min，加入2mL的4%（w/v）氢氧化钠水溶液，用蒸馏水定容至10mL，反应10min，于510nm处测吸光值。用0.5mL的蒸馏水代替0.5mL的样品作为溶剂空白。以芦丁为标品，TFC结果用芦丁当量（Rutin Equivalent，mg RE/g）表示。

1.2.2 总酚含量（total phenolic content，TPC）的测定总酚含量的测定是参照Vatai等的方法[8]进行的。将适当稀释的样品0.5mL与2.5mL的0.2N Folin-Ciocalteu试剂混合均匀，反应5min，加入2.0mL的7.5%（w/v）碳酸钠水溶液，室温避光反应2h，于747nm处测定吸光度值。用0.5mL蒸馏水代替0.5mL样品作为溶剂空白。实验以没食子酸（Gallic acid，GA）作为标品，TPC结果用没食子酸当量（mg GAE/g）表示。

1.2.3 原料处理 将万寿菊颗粒置于室温下干燥，粉碎机粉碎，筛选40～180目的万寿菊渣粉末，测得其水分含量为7.11%，其剩余油脂含量为0.82%。

1.2.4 万寿菊渣中的抗氧化活性成分的单因素实验

1.2.4.1 丙酮浓度的影响 准确称取1g脱脂粉碎的万寿菊渣于萃取釜中，萃取压力设为5.2MPa，按比例50∶1（v/w）分别泵入浓度为0%、20%、40%、60%、80%的丙酮溶液，120℃下萃取30min，考察不同浓度丙酮对萃取物中总酚、总黄酮含量的影响。

1.2.4.2 提取温度的影响 准确称取1g脱脂粉碎的万寿菊渣于萃取釜中，萃取压力设为5.2MPa，按比例50∶1（v/w）泵入40%的丙酮溶液，萃取温度分别为100、120、140、160、180℃，萃取30min，考察不同提取温度对萃取物中总酚、总黄酮含量的影响。

1.2.4.3 提取时间的影响 准确称量1g脱脂粉碎的万寿菊渣于萃取釜中，萃取压力设为5.2MPa，按比例50∶1（v/w）泵入浓度40%的丙酮溶液，萃取温度为120℃，分别萃取15、30、45、60、75min，考察不同提取时间对萃取物中总酚、总黄酮含量的影响。

1.2.4.4 液固比的影响 准确称取1g脱脂粉碎的万寿菊渣于萃取釜中，萃取压力设为5.2MPa，分别按液固比10∶1、30∶1、50∶1、70∶1、90∶1（v/w）泵入浓度为40%的丙酮溶液，120℃下萃取30min，考察不同液固比对萃取物中总酚、总黄酮含量的影响。

1.2.5 正交实验 以单因素实验为基础，选取丙酮浓度、温度、提取时间等对万寿菊渣中多酚类物质提取率影响较大的因素进行L9（34）正交实验，以TPC、TFC为评价指标，以得到较优的工艺参数。正交实验因素与水平见表1。

表1 因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.2.6 溶剂振荡提取法 取1g万寿菊渣粉末于锥形瓶中，分别用水、60%乙醇、70%丙酮作为萃取剂，置于恒温水浴摇床（100r/min）中，在50℃下萃取2h，过滤后测定各项指标。

1.2.7 其他亚临界提取法 亚临界水：准确称取1g脱脂粉碎的万寿菊渣于萃取釜中，萃取压力设为5.2MPa，分别按液固比50∶1（v/w）泵入去离子水，200℃下萃取45min，考察萃取物中总酚、总黄酮含量及其抗氧化活性。

亚临界乙醇：准确称取1g脱脂粉碎的万寿菊渣于萃取釜中，萃取压力设为5.2MPa，分别按液固比50∶1（v/w）泵入60%乙醇溶液，140℃下萃取30min，考察萃取物中总酚、总黄酮含量及其抗氧化活性。

1.2.8 样品提取液清除ABTS+·能力的测定 参考Pellegrini等[9]的方法并进行适当调整。将10mg ABTS+·溶到2.6mL的2.45mmol/L的过硫酸钾溶液中，室温避光反应12～16h，制成ABTS+·储备液。将储备液经过甲醇适当稀释，使其在734nm处吸光值为0.7±0.02，得到ABTS+·反应液。将1mL适当稀释样品与3mL ABTS+·反应液混合均匀，室温避光反应1h。于734nm处测定吸光度值。3mL甲醇代替3mL ABTS+·反应液作为样品空白。用1mL蒸馏水代替1mL样品作为溶剂空白，734nm波长处测定吸光值。结果以Trolox当量（Trolox Equivalent，mmol TE/g）表示。

1.2.9 样品提取液清除DPPH·能力的测定 参考Ramadan等[10]研究的方法。将DPPH·溶解于甲醇中制成1.75×10-4mol/L的DPPH·反应液。取2mL适当稀释的样品与2mL的DPPH·反应液混匀，室温避光反应1h，于517nm处测定吸光度值。2mL甲醇代替2mL DPPH·反应液作为样品空白。用2mL蒸馏水代替2mL样品作为溶剂空白，517nm处测定吸光值。结果以Trolox当量（Trolox Equivalent，mmol TE/g）表示。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 丙酮浓度对万寿菊渣萃取物中总酚、总黄酮含量的影响 由图2可知，丙酮浓度过低或过高对酚类物质和黄酮类物质的萃取影响均不利。丙酮浓度对多酚类物质的萃取有显著影响（p＜0.05）。丙酮浓度从0%增加到40%时，萃取物中多酚类和黄酮类物质含量上升，用40%丙酮提取时目标产物的含量最高，达到（92.66±1.71）mg GAE/g（总酚）和（109.17±3.62）mg RE/g（总黄酮），之后从40%～80%，目标产物的含量有所降低。因此，可初步认定最佳浓度应在20%～60%。

图2 丙酮浓度对万寿菊渣萃取物中总酚、总黄酮含量的影响Fig.2 The effect of different concentration of acetone on TPC and TFC extracts from marigold grounds

2.1.2 温度对万寿菊渣萃取物中总酚、总黄酮含量的影响 由图3可知，萃取物中的总多酚含量和总黄酮含量随着温度上升呈现先上升后下降的趋势。当温度从100℃上升到140℃时，黄酮与总酚的含量上升，但是从140℃上升到180℃时，二者的含量均不断降低，在140℃时提取物中总酚与总黄酮含量达到最高，分别为（130.79±1.71）mg GAE/g和（111.89±0.63）mg RE/g。这表明在一定温度范围内随着温度升高，多酚类物质在亚临界丙酮中溶解度也更大。但是当温度达到180℃时，总酚与总黄酮含量分别下降至（117.58±1.02）mg GAE/g和（107.29±1.89）mg RE/g，这说明温度大于140℃时，引起了多酚类物质的降解和与其他成分的反应。

图3 温度对万寿菊渣萃取物中总酚、总黄酮含量的影响Fig.3 The effect of different temperature on TPC and TFC of the extracts from marigold grounds

已有研究表明，从植物中得到的膳食纤维含有丰富的多酚类物质[11]。多酚类物质通过酯键和醚键与蛋白质和多糖键合在一起，使得膳食纤维具有了抗氧化活性，而亚临界条件可以促使膳食纤维水解，从而释放出更多的多酚类物质[12]。万寿菊花中含有大量的膳食纤维，因此多酚类物质含量在100℃至140℃时上升，可能是因为酯键和醚键的断裂。而当温度更高时，高温会破坏酚类物质结构使其分解或与其他成分发生反应从而使总酚和总黄酮含量降低[13]。因此，可初步认定最佳提取温度应在120～160℃。

2.1.3 萃取时间对万寿菊渣萃取物中总酚、总黄酮含量影响 由图4可知，萃取物中总多酚含量和总黄酮含量随着时间延长呈现先增加后降低再增加的趋势，多酚含量在45min达到最大值，而总黄酮含量在30min时最大。从15、30min，萃取物中的总多酚含量分别为（84.27±1.05）mg GAE/g、（98.15±1.23）mg GAE/g，总黄酮含量分别为（97.50±0.76）mg RE/g、（106.79±0.69）mg RE/g。当时间小于30min时，萃取出的多酚类物质随着时间延长而增加，这可能是由于时间越长，样品与溶剂的接触时间更充分，溶出的目标产物更多。但45～60min萃取出的目标物质随着时间延长而降低，可能是由于45min时溶出率达到平衡，因此时间延长不能提取出更多的目标产物，而亚临界提取在高温下进行，长时间的处理使得目标产物多酚类物质发生降解或聚合，从而使其含量降低。另外，60～75min时总黄酮与总酚的含量上升，可能由于长时间反应引起美拉德反应，中间产物的形成使得结果升高[14]。因此，可初步确定最佳提取时间应在15～45min。

图4 萃取时间对万寿菊渣萃取物中总酚、总黄酮含量的影响Fig.4 The effect of different time on TPC and TFC of the extracts from marigold grounds

2.1.4 液固比对万寿菊渣萃取物中总酚、总黄酮含量的影响 由图5可以看出，萃取物中总多酚含量和总黄酮含量随着液固比呈现先增加后降低并趋于稳定的趋势，总酚与总黄酮的含量均在30∶1时达到最大。但总体来说，提取液中总酚与黄酮含量随液固比的变化幅度很小，液固比对酚类及黄酮类的提取效率影响无显著性（p＞0.05）。

2.2 正交实验结果与分析

图5 液固比对万寿菊渣萃取物中总酚、总黄酮含量的影响Fig.5 The effect of different liquid to solid ratio on TPC and TFC of extracts from marigold grounds

表2 正交实验表Table 2 Orthogonal test

正交实验设计与结果见表2。由黄酮得率的分析结果可知，丙酮浓度对黄酮类的提取效率影响最大，较优工艺组合为A3B2C2，即丙酮浓度为60%、温度为140℃、提取时间30min时提取效果较佳。在验证实验中，较优组合A3B2C2条件下黄酮类物质的得率为15.03%±0.04%，均高于正交表中的任意组合。

由总酚得率的分析结果可知，提取时间对总酚提取效率的影响最大，较优工艺组合为A3B2C2，与黄酮类物质的最佳组合一致。在验证实验中，较优组合A3B2C2条件下多酚类物质的得率为13.12%±0.07%，均高于正交表中的任意组合。

表3 对比实验结果Table 3 Comparisons of different extraction methods

综合二者结果可得，较优工艺组合为：丙酮浓度60%，温度140℃，提取时间30min。用ABTS+·、DPPH·清除法对较优条件下提取物的抗氧化活性进行评价，可得其ABTS+·清除能力为（3.18±0.07）mmol TE/g，DPPH·清除能力为（3.42±0.12）mmol TE/g。

2.3 不同萃取方法的比较

传统的溶剂振荡浸提法所使用的溶剂有：纯水（50℃，2h）、70%乙醇水溶液（50℃，2h）、60%丙酮水溶液（50℃，2h）[15]。对比传统溶剂振荡浸提法、亚临界水（200℃，45min）、亚临界乙醇（60%，200℃，45min）提取法与亚临界丙酮方法（60%，140℃，30min）对萃取物中总酚、总黄酮含量及萃取物抗氧化活性的影响见表3。通过对比可以发现，亚临界方法可以更有效的提取万寿菊渣中的抗氧化活性物质。另外，采用亚临界丙酮的方法可以降低缩短提取时间，且相对亚临界乙醇和亚临界水的方法提取温度有所降低，对生产有利。

3 结论

本实验研究应用静态亚临界丙酮萃取技术，考察了不同丙酮浓度、萃取温度、萃取时间、液固比对萃取物中总酚、总黄酮的影响，结论如下：

3.1 单因素实验考察亚临界萃取条件包括丙酮浓度、温度、时间、液固比对总酚、总黄酮含量的影响，发现最佳提取条件应在以下范围：丙酮浓度20%～60%，温度120～160℃，时间15～45min。其中，液固比对提取效率无显著性影响（p＜0.05），不做进一步研究。通过正交实验，优化出亚临界丙酮萃取万寿菊渣黄酮、多酚类化合物的最佳条件为：丙酮浓度60%、温度140℃、提取时间30min。该条件下总黄酮得率为（15.03%±0.04）%，总酚得率为（13.12%±0.070%，ABTS·+清除能力为（3.18±0.07）mmol TE/g，DPPH·清除能力为（3.42±0.12）mmol TE/g。

3.2 在与其他萃取方法的比较中，相对于水、丙酮、乙醇的振荡浸提和亚临界水、亚临界乙醇萃取，采取本实验的方法能够在缩短提取时间、降低提取温度的情况下，有效提高抗氧化活性成分的得率，为亚临界提取万寿菊渣中抗氧化活性成分的产业化生产提供了一定的理论依据。

[1]Abad M J，Bernejo P，Palomino S S，et al.Antiviral activity of some South American medicinal plants[J].Phytother Res，1999，13：142-146.

[2]Lorenzo D，Loayza，Dellacassa，et al.Composition of the essential oil of Tagetes maxima Kuntze from Bolivia[J].Flavor Fragr J，2002，17：115-118

[3]Ramos L，Kristenson E M，Brinkman U A T.Current use of pressurized liquid extraction and subcritical water extraction in environmental analysis[J].Journal of Chromatography A，2002，975（1）：3-29.

[4]陈赟，李建明，章丽娟，等.亚临界水萃取技术及其在天然产物分析中的应用[J].中药材，2009，32（4）：636-641.

[5]何健，夏凡.亚临界水萃取技术在食品工业中的应用[J].江西食品工业，2010：45-47.

[6]Sereewatthanawut，Prapintip S，Watchariraruji K.Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysis[J].Bioresource Technol，2008，99（3）：555-561.

[7]Siddhuraju P Becker.Antioxidant properties of various solvent extracts of total phenolic constituents from three agroclimatic origins of drumstick tree（Moringa oleifera Lam）leaves[J].Journal of Agicultural and Food Chemistry，2003，51：2144-2155.

[8]Vatai T，Skerget M，Knez Z.Extraction of phenolic compounds from elder berry and different grape marc varieties using organic solvents and/or supercritical carbon dioxide[J].J Food Eng，2009，90：246-254

[9]Pellegrini N，VisioliF，Buratti S，et al.Direct analysis of total antioxidant activity of olive oil and studies on the influence of heating[J].Journal of Agicultural and Food Chemistry，2001，49：2532-2538.

[10]Ramadan M F，Kroh L W，Morsel J T.Racial scavenging activity of black cumin，coriander and niger crude seed oils and oil fractions[J].Journal of Agicultural and Food Chemistry，2003，51：6961-6969.

[11]Nararro-Gonzalez I，Garcis-Valverde V，Garcia-Alonso J，et al.Chemical profile，function and antioxidantproperties of tomato peel fiber[J].Food Research International，2011，44，1528-1535.

[12]Singh R P，Chidambara Murthy K N，Jayaprakasha G K.Studies on the antioxidant activity of pomegranate（Punica granatum）peel and seed extracts using in vitro models[J].Journal of Agicultural and Food Chemistry，2002，50（1）：80-86

[13]何李.石榴籽渣多酚和其抗氧化性分析及亚临界水萃取的研究[D].北京：中国农业大学，2010.

[14]丛艳波，张永忠，刘潇.亚临界水提取槐角中总异黄酮的研究[J].中草药，2010，14（5）：717-720.

[15]龚英.万寿菊渣中抗氧化活性成分的提取、分析及鉴定的研究[D].北京：中国农业大学，2010.