芹菜素对人肺癌A549细胞凋亡及相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响

潘雪刁，杨周萍，周四桂，杨志英，臧林泉，王桂香

芹菜素对人肺癌A549细胞凋亡及相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响

潘雪刁，杨周萍，周四桂，杨志英，臧林泉，王桂香

目的 研究芹菜素对人肺癌 A549 细胞增殖抑制和凋亡诱导作用与 Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响。

芹菜素； 肺肿瘤； 细胞增殖； 细胞凋亡； bcl-2 相关 X 蛋白； 原癌基因蛋白质 c-bcl-2

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2013, 8(4):259-263

肺癌是全球范围内最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一[1]，也是我国第一大癌症，其发病率及死亡率增长最为迅速[2]。目前肺癌的主要治疗手段是化疗，但化疗的毒副作用如骨髓抑制等却限制了其应用。研发新型活性高、毒副作用小的抗肺癌药物一直是肿瘤治疗领域的重要任务，近年来中药抗肺癌研究也取得了很大进展。

芹菜素（apiginin，API），又称芹黄素，是一种天然存在的黄酮类化合物，广泛分布于温热带的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量为高，具有广泛的药理作用[3]，其对肿瘤的防治作用及其机制得到广泛的关注和研究[4-11]，但有关芹菜素抗肺癌作用的实验研究尚少。本实验观察了芹菜素对人肺癌细胞株A549 的增殖抑制以及诱导凋亡作用，初步探讨其促进凋亡的机制，为肺癌的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物、试剂 芹菜素（质量分数 ≥ 98 %，批号：22806）购自上海阿拉丁公司；MTT、Hoechst 33258、DMSO、亮肽酶、抑肽酶、叠氮钠、二硫苏糖醇购自美国 Sigma 公司；DMEM 培养基和胎牛血清（FBS）均购自美国 Gibco 公司；AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；人抗兔 Bax、Bcl-2 及GAPDH 抗体购自美国 Abcam 公司；羊抗兔二抗购自美国 CST 公司；PVDF 膜购自美国 Millipore公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验仪器 EPICS XL 分析型流式细胞仪为美国 Beckman 公司产品；Zeiss Axio Observer A1荧光倒置显微镜为德国 Carl Zeiss 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞株及细胞培养 人肺癌细胞株 A549购自中国科学院上海细胞库；培养于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液中，于 37 ℃、5% CO2、95% O2细胞培养箱内常规传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 MTT 法检测细胞增殖抑制率 将 A549细胞以 1 × 104个/孔接种于 96 孔板中，待细胞贴壁后，分别加入终浓度为 0、10、20、40、80 μmol/L芹菜素，每孔 200 μl，每个浓度设置 6 个平行孔，培养 24、48、72 h 后，向每孔中加入 5 g/L 的MTT 20 μl 继续培养 4 h，弃上清，向每孔中加入DMSO 100 μl 溶解结晶体，置于摇床振荡 10 min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪 570 nm 波长处测定每孔吸光度值（A），并计算细胞增殖抑制率（%）=（对照孔 A 值 - 加药孔 A 值）/对照孔 A 值 × 100%。实验重复 3 次。

1.2.3 Hoechst 33258 细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变 细胞处理同“1.2.2”项方法，芹菜素作用 24 h 后，吸去培养液，用 PBS 清洗2 次，迅即加入 40 g/L 的多聚甲醛液固定 10 min后，吸去固定液，以 PBS 清洗 1 次，加入 5 mg/L的 Hoechst 33258，染色 10 min，用 PBS 清洗3 次后，自然干燥，在 Zeiss Axio Observer A1 荧光倒置显微镜下以 340 nm 激发光观察细胞凋亡形态并随机拍照。实验重复 3 次。

1.2.4 流式细胞仪 AnnexinV-FITC/PI 双染色法检测细胞凋亡率 将 A549 细胞以 1 × 105个/孔接种于 6 孔板中，待细胞贴壁后，分别加入终浓度为 0、10、20、40、80 μmol/L 芹菜素，每孔 1 ml，继续培养 24 h 后，按照 AnnexinV- FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，采用流式细胞仪进样测定，根据 Annexin V-FITC(X)/PI（Y 轴）荧光做对数散点图，可获得由 4 个象限组成的双参数图：左上象限（K1）为细胞收集过程中产生的损伤细胞，右上象限（K2）为晚期凋亡细胞和坏死细胞，左下象限（K3）为活细胞，右下象限（K4）为早期凋亡细胞，每个象限的细胞数即为受检总细胞数中所占的比例。实验重复 3 次。

1.2.5 Western blot 法检测 Bax、Bcl-2 蛋白表达 细胞处理同“1.2.4”项方法，芹菜素作用 24 h后，收集细胞，在每管细胞中加入 100 μl 的蛋白裂解液后，取 20 μl 的细胞裂解液加入 5 μl 上样缓冲液中，沸水浴 5 min，12 000 × g 离心 3 min，去除不溶性蛋白，考马斯亮蓝 G-250 法进行总蛋白定量，每泳道上样量为 25 μg 总蛋白，经 10% SDS-PAGE 电泳后转移至 PVDF 膜上。用含 5%脱脂牛奶的 TBST 室温下封闭 90 min，加入稀释好的一抗 Bax（1∶5000）、Bcl-2（1∶1000），4 ℃ 孵育过夜。TBST 洗膜后，加 5 ml 1∶5000 稀释的羊抗兔二抗，室温孵育 1 h 后，TBST 洗膜，然后加入 ECL 化学发光液，X 光片暗室曝光、显影及定影。采用 WO-9413B 型凝胶成像系统自带软件Gelpro 32 分析胶片中的蛋白条带，以各组灰度面积的乘积/内参照（GAPDH）灰度面积的乘积反映相对蛋白表达丰度。实验重复 3 次。

1.3 统计学处理

应用 SPSS 11.0 统计软件进行数据处理，计量资料以表示，组间差异显著性比较采用t 检验，P < 0.05 为差异有统计学意义。

表1 不同浓度芹菜素于不同作用时间对 A549 细胞增殖的抑制率（%，，n = 3）Table1 Inhibition of A549 cells after different time points of incubation with API at various concentrations (%,, n = 3)

表1 不同浓度芹菜素于不同作用时间对 A549 细胞增殖的抑制率（%，，n = 3）Table1 Inhibition of A549 cells after different time points of incubation with API at various concentrations (%,, n = 3)

注：与空白对照组比较，**P < 0.01。Note:**P < 0.01 vs. control group.

?

图1 Hoechst 33258 染色观察细胞核的形态学变化（× 100）Figure1 Morphological changes of the nucleus of A549 cells were observed by Hoechst 33258 staining (× 100)

2 结果

2.1 芹菜素对 A549 细胞增殖的抑制作用

结果见表 1，以芹菜素不同浓度（10、20、40、80 μmol/L）和不同时间（24、48、72 h）处理 A549细胞后，细胞增殖受到明显的抑制，与空白对照组相比具有显著性差异（P < 0.01），当同一芹菜素浓度作用时间逐渐延长或同一作用时间芹菜素浓度逐渐升高时，对 A549 细胞的增殖抑制作用逐渐增强，呈浓度和时间依赖性。

2.2 芹菜素诱导 A549 细胞凋亡的形态学变化

以 10 ～ 80 μmol/L 芹菜素处理 A549 细胞24 h 后，在荧光显微镜下观察，可见部分细胞皱缩，出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡形态学改变（如箭头所示），见图 1B ～ E。而空白对照组以活细胞为主，核呈圆形或椭圆形，为蓝色均匀淡染，细胞核膜完整，未见凋亡细胞，见图 1A。

表2 不同浓度芹菜素作用 24 h 对 A549 细胞凋亡率的影响（%，，n = 3）Table2 Apoptotic rate of A549 cells induced by API at various concentrations after 24 h (%,s, n = 3)

表2 不同浓度芹菜素作用 24 h 对 A549 细胞凋亡率的影响（%，，n = 3）Table2 Apoptotic rate of A549 cells induced by API at various concentrations after 24 h (%,s, n = 3)

注：与空白对照组比较，P < 0.01。Note:**P < 0.01 vs. control group.

?

图2 不同浓度芹菜素对 A549 细胞凋亡率的影响Figure2 Apoptotic rate of A549 cells induced by incubation with API

2.3 芹菜素对 A549 细胞的凋亡诱导作用

芹菜素对 A549 细胞的凋亡诱导作用结果见表 2、图 2，10 ～ 80 μmol/L 芹菜素处理 24 h 后，细胞凋亡率随着芹菜素浓度的升高逐渐增加，与空白对照组相比具有显著性差异（P < 0.01）。提示芹菜素对 A549 细胞的凋亡诱导效应具有浓度依赖性。

2.4 芹菜素诱导 A549 细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的改变

结果见图 3，10 ～ 80 μmol/L 芹菜素处理 24 h后，促凋亡蛋白 Bax 随着芹菜素浓度升高表达逐渐增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 随着芹菜素浓度升高表达逐渐减少。对条带的灰度值进行统计学分析，随芹菜素浓度升高，Bax/Bcl-2 比值逐渐增大，与空白对照组比较差异具有统计学意义（P < 0.05，P < 0.01），见图 4。此结果提示芹菜素可能通过上调 Bax 和下调 Bcl-2 蛋白表达诱导 A549 细胞凋亡。

图3 芹菜素对 A549 细胞 Bax 和 Bcl-2 表达的影响Figure3 Expression of Bax and Bcl-2 in A549 cells after API treatment

图4 Bax 和 Bcl-2 蛋白表达比值（与空白对照组相比，*P < 0.05；**P < 0.01）Figure4 Ratio of the expression of Bax and Bcl-2 (*P < 0.05;**P < 0.01 vs. control)

3 讨论

细胞的增殖、分化和凋亡，维持着正常组织的生长平衡。如果打破这种平衡，凋亡受抑，细胞死亡率降低，机体不能重新恢复调节，表现出生长优势最终形成肿瘤。细胞凋亡受到抑制有可能导致肿瘤的发生，而促进肿瘤细胞的凋亡则可以促使肿瘤的消退。

芹菜素作为一种植物提取的活性成分，具有资源丰富，毒性低的优点，大量研究表明，芹菜素对多种肿瘤细胞均有抑制作用，但有关芹菜素抗肺癌作用研究鲜有报道。本实验首先使用不同浓度芹菜素作用 A549 细胞不同时间，MTT 法检测细胞增殖抑制情况，结果发现芹菜素呈浓度和时间依赖性地抑制 A549 细胞增殖。通过 Hoechst 33258 细胞核染色和流式细胞仪检测结果进一步证实了芹菜素可呈浓度依赖性地诱导人肺癌 A549 细胞凋亡。

芹菜素对癌细胞促凋亡作用是通过多种途径实现的，其中包括参与癌细胞凋亡基因调控，调节蛋白质表达，阻滞细胞周期，干扰信号传导等[12]。本研究发现芹菜素可呈浓度依赖性地下调抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达，同时上调促凋亡蛋白 Bax 表达，我们推测芹菜素诱导 A549 凋亡的机制可能与上调 Bax 和下调 Bcl-2 的表达，导致 Bax/Bcl-2比值增加。但由于细胞凋亡的调节非常复杂，对芹菜素抗肺癌机制仍需更进一步的研究。

综上所述，本研究发现芹菜素作为一种天然存在的黄酮类化合物，能够抑制人肺癌 A549 细胞的增殖，并诱导其凋亡，可为芹菜素应用于肺癌的临床治疗提供实验依据。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.

[2] Zeng HM, Zheng RS, Zhang SW, et al. Trend analysis of cancer mortality in China between 1989 and 2008. Chin J Oncol, 2012, 34(7): 525-531. (in Chinese)

曾红梅, 郑荣寿, 张思维, 等. 1989-2008年中国恶性肿瘤死亡趋势分析. 中华肿瘤杂志, 2012, 34(7):525-531.

[3] Wang HD, Liu AL, Du GH. New progress in the pharmacology of apigenin. Chin J New Drugs, 2008, 17(18):1561-1565. (in Chinese)

王海娣, 刘艾林, 杜冠华. 芹菜素药理作用的研究进展. 中国新药杂志, 2008, 17(18):1561-1565.

[4] Lin LW, Xin Q. Advances in studies on antitumor effect of apigenin. J Jining Med Coll, 2010, 33(3):221-223. (in Chinese)

林丽文, 辛勤. 芹菜素抗癌作用研究进展. 济宁医学院学报, 2010, 33(3):221-223.

[5] Ren XC, Zhang HY, Li YM. Inhibitory effects of apigenin on human ovarian cancer cell strain SKOV3 growth. Mod J Integrated Traditional Chin Western Med, 2010, 19(35):4532- 4534. (in Chinese)

任秀聪, 张宏煜, 李彦敏. 芹菜素抑制卵巢癌细胞株SKOV3生长的作用研究. 现代中西医结合杂志, 2010, 19(35):4532-4534.

[6] Liu J, Liu F, Xia H, et al. Sensitization of human cervical cancer HeLa cells to TRAIL-induced apoptosis by apigenin via constitutively activating JNK. China J Mod Med, 2011, 21(25):3095-3100, 3105. (in Chinese)

刘杰, 刘飞, 夏红, 等. 芹菜素通过组成性激活JNK敏化TRAIL诱导HeLa细胞凋亡. 中国现代医学杂志, 2011, 21(25):3095-3100, 3105.

[7] Wu YH, Ai XH, Dai WX, et al. Induction of apoptosis through up-regulating PTEN in human hepatocellular carcinoma HepG2 cell line by apigenin. China J Mod Med, 2009, 19(12):1793-1796. (in Chinese)

伍尤华, 艾小红, 戴文香, 等. 芹菜素通过上调 PTEN 蛋白表达诱导人肝癌细胞凋亡. 中国现代医学杂志, 2009, 19(12):1793-1796.

[8] Meng Y, Li H, Ma QY, et al. Inhibitory effect of apigenin on the invasive ability of the colon cancer cell SW480 in vitro. J Mod Oncol, 2011, 19 (8):1522-1524. (in Chinese)

孟勇, 李华, 马清涌, 等. 芹菜素对人结肠癌细胞株SW480体外侵袭能力的抑制作用. 现代肿瘤医学, 2011, 19(8):1522-1524.

[9] Jiang D, Liu F, Huang QL. Selectively inhibition of cell viability and induction of apoptosis in human gastric cancer BGC-823 cell line by apigenin. J Hunan Normal Univ (Med Sci), 2010, 7(3):11-13. (in Chinese)

蒋迪, 刘飞, 黄秋林. 芹菜素选择性抑制人胃癌细胞活力和诱导细胞凋亡. 湖南师范大学学报(医学版), 2010, 7(3):11-13.

[10] Li MY, Huang PC. Chemosensitization effects of apigenin on cisplatin in human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells. Chin Pharmacological Bull, 2012, 28(1):88-92. (in Chinese)

李明勇, 黄培春. 芹菜素对人鼻咽癌CNE-2Z 细胞化疗敏感性的增强作用. 中国药理学通报, 2012, 28(1):88-92.

[11] Zheng ZW, Lun YN, Zhao LL. Effect of apigenin from mallotus apelta on proliferation and apoptosis in nude mice bearing human gastric carcinoma. Chin J Exp Traditional Med Formulae, 2012, 18(13):214-216. (in Chinese)

郑作文, 伦玉宁, 赵丽丽. 白背叶提取物芹菜素对裸鼠人胃癌细胞移植瘤生长及凋亡的影响. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(13): 214-216.

[12] Cai J, Liu AW, Zhang SH. Research on molecular mechanism of apigenin’s anticarcinogenic activity on cancer cells. J New Chin Med, 2010, 42(3):105-107. (in Chinese)

蔡婧, 刘安文, 张树辉. 芹菜素抗肿瘤作用分子机制的研究进展.新中医, 2010, 42(3):105-107.

Effect of apigenin on apoptosis an d expression of Bax and Bcl-2 in A549 human lung cancer cells

PAN Xue-diao, YANG Zhou-ping, ZHOU Si-gui, YANG Zhi-ying, ZANG Lin-quan, WANG Gui-xiang

Objective To investigate the effect of apigenin on proliferation, and apoptosis, as well as Bax and Bcl-2 protein expression in human lung cancer cell line A549.Methods A549 cells cultured in vitro were treated with 10 ～ 80 μmol/L different concentration of apigenin. MTT was used to detect the inhibitory rates according to the formula. Apoptosis of A549 cells was observed in a fluorescence microscope by Hoechst 33258 staining and quantified by flow cytometry using annexin V-FITC/PI staining. The expressions of apoptosis-related protein Bax and Bcl-2 were analyzed by Western blot.Results The inhibition of proliferation by apigenin was concentration-dependent and time-dependent. A549 cells treated with apigenin showed significant morphological changes in different apoptotic phases. The apoptotic rate was concentration-dependently increased. Western blot analysis indicated that apigenin increased the protein level of Bax, and reduced the protein level of Bcl-2.Conclusion Apigenin can inhibit proliferation and induce apoptosis of human lung cancer cell line A549, which might be related with up-regulated expression of Bax and down-regulated expression of Bcl-2.

Apigenin; Lung neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis; bcl-2-associated X protein; Proto-oncogene proteins c-bcl-2

WANG Gui-xiang, Email: wgx306@yahoo.com.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.004

国家自然科学基金（81102465）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2011zx09102-001-31）；广东省科技计划项目（2010B031 500034）；广州市科技计划项目（2010J-E091）

510006 广州，广东药学院药科学院药理系新药筛选与药效学评价中心（潘雪刁、杨周萍、周四桂、臧林泉、王桂香）；518035 深圳市第二人民医院营养科（杨志英）

王桂香，Email：wgx306@yahoo.com.cn

2013-06-25

方法 10 ～ 80 μmol/L 不同浓度芹菜素作用 A549 细胞，采用 MTT 法检测芹菜素对 A549 细胞增殖抑制作用；Hoechst 33258 细胞核染色法观察芹菜素诱导细胞凋亡形态学的变化；流式细胞仪 AnnexinV- FITC/PI 双染色法检测细胞凋亡率；Western blot 法检测凋亡相关蛋白 Bax 和 Bcl-2表达的变化。

结果 MTT 法显示，芹菜素对 A549 细胞有显著的增殖抑制作用（P < 0.01），且具浓度和时间依赖性；荧光显微镜下观察到芹菜素处理组细胞出现典型的凋亡形态学改变：细胞核固缩、染色质凝集和核碎片化等；流式细胞仪分析结果显示，芹菜素呈浓度依赖性诱导 A549 细胞凋亡；Western blot结果显示，促凋亡蛋白 Bax 随着芹菜素浓度升高表达增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 随着芹菜素浓度升高表达减少。

结论 芹菜素具有抑制人肺癌 A549 细胞增殖，诱导其凋亡的作用，其机制可能与上调 Bax 蛋白表达和下调 Bcl-2蛋白表达有关。

Author Affiliations: New Drug Screening and Pharmacodynamics Evaluation Center, Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China (PAN Xue-diao, YANG Zhou-ping, ZHOU Si-gui, ZANG Lin-quan, WANG Gui-xiang); Nutritional Department, The Second People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518035, China (YANG Zhi-ying)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(4):259-263