虎眼万年青EST文库构建和Syntaxin基因的克隆及生物信息学分析

陈 茜，王志标，唐 微，王 伟，程克棣，孔建强

虎眼万年青EST文库构建和Syntaxin基因的克隆及生物信息学分析

陈 茜，王志标，唐 微，王 伟，程克棣，孔建强

目的 构建虎眼万年青 EST 文库，筛选相关基因并对其进行功能鉴定。

基因文库； Qa-SNARE 蛋白质类； 虎眼万年青

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2013, 8(4):247-253

虎眼万年青（Ornithogalum saundersiae）是原产于南非的观赏植物，1992 年从中发现了具有显著抗癌活性的甾体类皂苷化合物 OSW-1[1]，它对多种恶性肿瘤细胞都有非常强的抑制作用，是迄今所发现的抗癌活性极强的化合物之一，其 IC50值在0.1 ～ 0.7 nmol/L 之间，高出临床应用的抗癌药物[阿霉素（adriamycin）、顺铂（cisplatin）、喜树碱、丝裂霉素 C 和紫杉醇等] 10 ～ 100 倍，更重要的是它对正常细胞几乎没有抑制作用，具备非常良好的药用前景[1-2]。然而，由于 OSW-1 在虎眼万年青中含量极低，限制了它的进一步应用。因此，寻找一种切实可行的替代方法来提高虎眼万年青皂苷产量对于加快其成药性研究具有非常重要的意义。合成生物学（synthetic biology）的迅猛发展给OSW-1 的规模化制备提供了一个很好的契机[3-5]。

合成生物学的物质基础是核酸，克隆天然产物生物合成相关功能酶基因以及重要的调控基因并对其进行功能鉴定是进行天然产物合成生物学研究的关键一步。基于此，本论文通过 SMART（switching mechanism at 5'end of mRNA template）法构建了虎眼万年青的全长 cDNA 文库，并利用该文库筛选到了细胞囊泡转运和物质分泌重要调控蛋白之一的 Syntaxin 的编码基因，对其进行了序列分析和初步的表达研究，从而为进一步的功能鉴定奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 植物材料 虎眼万年青鳞茎自澳大利亚引进，经过诱导后形成愈伤，然后重新诱导出鳞茎。取出无菌鳞茎，放入液氮中速冻，于 -70 ℃ 保存备用。

1.1.2 菌种和试剂 RNeasy plant mini kit 购自德国 Qiagen 公司；大肠杆菌 Trans1-T1、Transetta (DE3) 以及 T-A 克隆时所用试剂盒 pEASYTMBlunt zero cloning kit 购自北京 Transgen 公司；表达载体 pET-28a(+) 购自德国 Novagen 公司；KOD-Plus 聚合酶购自日本 Toyobo 公司；鼠源His-Tag 单克隆抗体、酶标二抗（山羊抗小鼠 IgG）；IPTG 和卡那霉素购自北京纽朴生物技术有限公司；快速连接试剂盒 In-FusionTMadvantage PCR cloning kit w/cloning enhancer 试剂盒购自美国Clontech 公司；蛋白 marker 购自立陶宛 Fermentas公司。

大肠杆菌在不加抗生素的 LB 培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl）中进行培养，转化菌株的选择和诱导在加有 50 μg/ml卡那霉素的 LB 中进行。

1.1.3 主要仪器 Mastercycle/5333000.018 高精度梯度 PCR 仪购自德国 Eppendorf 公司；Biospectrum 凝胶成像仪购自美国 UVP 公司；Model 3000Xi 琼脂糖凝胶电泳仪和 PowerPac 电泳仪均购自美国 Bio-Rad 公司；VCX130 超声波破碎仪购自美国 Sonics 公司。

1.2 方法

1.2.1 总 RNA 的提取和 cDNA 文库的构建 取50 ～ 100 mg 的虎眼万年青鳞茎，液氮研磨成粉，采用 CTAB 法提取总 RNA。通过紫外分析仪检测所提 RNA 的浓度、纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性。采用 Oligote x mRNA mini kit 纯化总 RNA。使用 SMARTTMPCR cDNA synthesis kit合成 cDNA 一链和二链。使用 QIAquick PCR purification kit 纯化扩增得到的双链 cDNA，进行全长 cDNA 的均一化。均一化的 cDNA 经 Sfi 酶切后，电泳检测，将酶切产物的 1 ～ 3 kb 区域切下，并将产物回收后与 pDNR-LIB 载体连接，将连接产物加到 0.25 μm Millipore 纯化膜上脱盐纯化 1 h，电击转化到大肠杆菌 DH10B 中，菌液涂于氯霉素平板上。随机挑取克隆进行菌落 PCR 鉴定，电泳检测插入片段大小及小片段比率。

1.2.2 EST 测序及分析 在 ABI 3730XL 全自动 DNA 测序仪上，随机对文库中的 1440 个cDNA 克隆进行 5′ 末端测序分析，测序通用引物分别为 T7，EST 测序和生物信息学分析由北京华大基因完成。用 phrap 软件对 Clean EST 序列进行组装和拼接，得到所测 EST 的相应 Unigene 数据。用 BLASTP（BLASTX）将 Unigene 数据与COG（clusters of orthologous groups of proteins）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）进行比对分析（期望值标准为 1e ～ 10），获得虎眼万年青表达基因的功能注释及其 COG 功能分类。

1.2.3 Syntaxin 基因的克隆 从测序的 EST 序列中发现两段基因分别与 Syntaxin 43 基因具有同源性，而且推断可能分别是同一个 Syntaxin 基因的5' 端和 3' 端。因此，设计引物 F10343-1/R10343-1和 F10343-2/R10343-2（表 1），以虎眼万年青 cDNA为模板，通过巢式 PCR 的方法克隆得到一条长约为 1300 bp 的条带，将其通过平末端连接的方式克隆到载体 pEASYTM-Blunt Zero 中，获得重组质粒pEASY-syntaxin 43，送样测序。

1.2.4 Syntaxin 蛋白的生物信息学分析 利用NCBI 的 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/orfig.cgi）软件对扩增得到的 cDNA 序列进行ORF 分析；利用 Protein Blast（http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PRO GRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW _DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome）进行Syntaxin 氨基酸的同源性分析；利用 Pfam（http:// pfam.janelia.org/search）程序对克隆得到的基因编码蛋白进行蛋白家族预测；用 Expasy 中的工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）预测Syntaxin 蛋白的理化性质；通过 TMpred（http:// www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）预测 Syntaxin 蛋白的跨膜区；利用 Signal P4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对 Syntaxin蛋白进行信号肽预测；采用 TargetP 1.1（http://www. cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析预测 Syntaxin 的细胞定位。

表1 本实验中用到的引物Table1 Primers used in this experiment

1.2.5 Syntaxin 基因的表达和免疫印迹

1.2.5.1 含 Syntaxin 基因的大肠杆菌表达载体的构建 以 Fet28a10343/Ret28a10343 为引物，pEASY-syntaxin 43 为模板，扩增得到的序列与用EcoR I/Hind III 酶切的 pET-28a(+) 进行 In-Fusion连接，连接产物转化 E.coli Trans1-T1，37 ℃ 培养，挑取阳性克隆进行测序。测序正确的载体命名为pET28a10343，用于原核表达。其中涉及到的分子生物学技术参考文献[6]，In-Fusion 连接的相关操作参考 Clontech 公司的说明书。

1.2.5.2 Syntaxin 基因在 E.coli 中的表达及鉴定 采用 CaCl2法将 pET28a10343 转化到 E.coli Transetta(DE3) 中，筛选正确后，挑取阳性克隆接种到 10 ml 加有 50 mg/L 卡那霉素的 LB 培养基中，37 ℃ 振荡培养到 OD600= 0.6 左右，取 1 ml菌液，13 000 × g 离心 1 min，弃上清，沉淀用无菌 ddH2O 涮洗 2 遍，然后转接于加有 50 mg/L卡那霉素的 LB 培养基中，37 ℃ 培养至 OD600= 0.6。13 000 × g 离心 1 min，弃上清，沉淀用无菌ddH2O 涮洗 3 遍，然后将沉淀转接于加有 50 mg/L卡那霉素的 LB 培养基中，加入 0.1 mmol/L IPTG，在 16 ℃ 诱导 16 h，取 1.5 ml 菌体，加入裂解液A（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，5% 甘油，0.1 mmol/L DTT）300 μl，超声破碎，13 000 × g 离心 18 min，取上清 15 μl，SDS-PAGE 电泳。

包涵体形式存在的蛋白提取，需在以上步骤，即13 000 × g 离心 18 min 后，弃上清，加入 6 mol/L尿素 50 μl，于 -20 ℃ 沉淀 1 h 后 13 000 × g 离心 18 min，取上清 15 μl，SDS-PAGE 电泳。

1.2.5.3 E.coli 重组 Syntaxin 的蛋白印迹分析 所用一抗为抗 His-Tag 的小鼠单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠 IgG（1∶2000），以带有 His 标签的重组质粒 pET28a10343 组为实验组，以pET-28a(+) 空载体组为对照，用 eECL Western blot kid 化学发光试剂盒检测 Syntaxin 的蛋白表达。

图1 菌落 PCR 电泳结果Figure1 The results of clony PCR

图2 Syntaxin 基因电泳结果Figure2 PCR amplification of Syntaxin gene

2 结果

2.1 虎眼万年青全长 cDNA 文库的构建

文库构建好后，取 1 μl 菌液涂平板（直径15 cm），计算平板上的库容数，约为 750个，通过计算可以得出菌液滴度为 7.5 × 105cfu/ml。转化菌1.4 ml，所以库容为 1 × 106，以整个连接计算，库容大于 3 × 106。从文库中随机挑取 24 个克隆进行菌落 PCR 鉴定，电泳结果见图 1。结果显示，插入片段平均大于 1.5 kb， 且分布在 1 ～ 3 kb 之间。

2.2 EST 分析

对随机挑取的 1440 个 cDNA 克隆进行测序，获得 1398 个有效序列，其中含有 1292 个高质量 EST 序列。利用 Phrap 软件进行 EST 序列组装，得到单一基因序列（unigene）为 1146 条，其中包括 98 个重叠群（contig），1048 个单一 EST序列（singlet）。分析表明，EST 文库的全长率 54%，冗余率 3.3%。进一步的比对分析表明，1146 条虎眼万年青单一基因序列在 COG 数据库中只有266 个序列可获得生物学功能注释，因此，如果只采用 COG 一种数据库进行分析，虎眼万年青鳞茎表达基因的鉴定率仅为 23% 左右。

2.3 Syntaxin 基因的克隆及生物信息学分析

通过巢式 PCR，从虎眼万年青中分离得到一条长为 1265 bp 的条带（图 2），通过生物信息学分析表明，扩增得到的 Syntaxin 基因的 ORF 区共810 bp，编码 269 个氨基酸，5' 非翻译区为 145 bp，3' 非翻译区为 310 bp。将该序列递交给 GenBank，获得注册号是 KF241989。通过 Protein Blast 分析表明，该基因编码蛋白和植物的 Syntaxin 同源性较高，而且在植物中比较保守（83.58% 的同源性）（图 3）。

利用 Pfam（http://pfam.janelia.org/search）程序对克隆得到的基因编码蛋白进行蛋白家族预测，结果表明，该基因最有可能编码一个 Syntaxin 蛋白（E-value = 6.7E-13），编码序列中含有一个 SNAREdomain（179 ～ 241 aa）。

通过 ProtParam 对该蛋白进行理化性质分析，结果表明该蛋白分子式为 C1300H2113N381O423S11，分子量是 30.2 kD，pI = 5.17，该蛋白不稳定，是个亲水蛋白（GRAVY = -0.567），提示其可能是膜结合蛋白。

通过 TMpred 分析，揭示 Syntaxin 有 1 个跨膜区域（246 ～ 264 aa），而且 Score值很高，说明Syntaxin 很有可能是一个跨膜蛋白。蛋白质序列含有跨膜区提示它可能作为膜受体起作用，也可能是定位于膜的锚定蛋白或者离子通道蛋白等。含有跨膜区的蛋白质往往和细胞的功能状态密切相关，从Syntaxin 的功能来分析，作为膜的锚定蛋白的可能性较大。

利用 Signal P4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）对 Syntaxin 蛋白进行信号肽预测，结果表明，该蛋白没有信号肽，不是一种分泌蛋白，推测该蛋白极有可能是一种膜结合蛋白，这和TMpred 分析是一致的。采用 TargetP 1.1（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析预测 Syntaxin的细胞定位，结果表明，该蛋白定位于线粒体或分泌途径的可能性很少（得分分别为 0.074 和0.070），可能定位在其他的细胞位置，如膜上（得分为 0.936）。

2.4 含 Syntaxin 基因的表达载体的构建

采用快速连接 In-Fusion 技术将 Syntaxin 基因插入大肠杆菌表达载体 pET-28a(+) 的多克隆位点 EcoR I/Hind III 之间，得到的重组克隆送样测序。结果表明，载体构建正确，命名为 pET28a10343，含有完整的 Syntaxin 基因。将 pET28a10343 转入大肠杆菌 Transetta(DE3) 中，筛选得到阳性克隆E.coli[pET28a10343]。

2.5 重组 Syntaxin 的 SDS-PAGE 分析

E.coli[pET28a10343]在 16 ℃ 诱导 16 h 后，取 1 ml 菌液，13 000 × g 离心 1 min，弃上清，沉淀超声破碎后，分别对上清和包涵体进行 12% 的SDS-PAGE 分析（图 4），结果显示，经过诱导的E.coli[pET28a10343]重组菌上清中诱导条带不明显，而包涵体中出现了一条大小为 35 kD 的条带，而对照未经诱导的 E.coli[pET28a10343]没有出现条带，初步表明 Syntaxin 基因在 E.coli 中成功表达，而且是以包涵体形式存在。

2.6 重组 Syntaxin 蛋白的免疫印迹分析

为确证 Syntaxin 基因得到表达，进行了免疫印迹分析。离心收集 E.coli[pET28a10343]的菌体，用超声破碎液进行 SDS-PAGE 电泳，采用 Western blot 进行检测（图 5）。结果表明，与对照相比，E.coli[pET28a10343]经免疫印迹后，在相应的位置上出现了一条相应的杂交带。因此，确认重组的Syntaxin 蛋白具有特异的免疫活性，表明 Syntaxin基因在 E.coli 中得到了表达。

图4 重组 Syntaxin 的 SDS-PAGE 结果Figure4 Expression of recombinant Syntaxin protein

图5 E.coli 重组 Syntaxin 蛋白的 Western blot 结果Figure5 Western blot analysis of rexombinant Syntaxin protein

3 讨论

Syntaxin 是 SNARE（soluble N-ethylmaleimidesensitive factor attachment protein receptor）复合物中最重要的组成成分[7-8]，参与调控细胞囊泡转运和物质分泌过程，在介质质膜的导向、锚定、融合和胞吐作用中起着核心作用，是参与调节神经内分泌-免疫炎性细胞释放神经递质或炎性介质不可少的结构和功能单位。和动物中的 Syntaxin 的研究相比，植物中 Syntaxin 的研究相对较少。现在已知 Syntaxin 在植物中成员众多[9]，参与了多种生理作用。Syntaxin 蛋白通过和 SNARE 蛋白相互作用，参与植物细胞膜结构的融合[10-11]，此外，Syntaxin 还参与了植物抗病[12-13]等生理过程，因此开展针对植物 Syntaxin 基因的研究具有很重要的意义。

在本项目中，全长 Syntaxin 基因的克隆方法对今后利用该文库筛选其他基因具有借鉴意义。在本论文中，我们从 EST 文库中分别得到了两条和Syntaxin 具有同源性的片段，如何判断这两条片段是否属于同一基因，对于能否快速获得全长该基因很重要。如果推断这两条片段不属于同一个基因，则需要通过 RACE 将 Syntaxin 基因缺失的部分扩增出来，需要花费一定的时间。而如果能有效地判断这两个片段属于同一个基因，则只需根据这两个片段序列，设计特异的引物，通过常规巢式 PCR就能快速地克隆得到我们需要的全长 cDNA，由此看来，通过生物信息学对两个片段是否属于同一个基因是快速克隆该全长基因的前提。在本实验中，我们首先通过 Blast Protein 对这两个序列分别进行同源序列查找，结果发现，这两个序列和同一个已知氨基酸序列的同源性近似相等，而且，GC 含量分析表明，这两个片段的 GC 含量比较相似，根据这两点，初步判断这两个序列分别属于同一个Syntaxin 基因的 5' 和 3' 端。我们据此设计了特异的引物，通过常规 RT-PCR，快速地克隆得到了该Syntaxin 基因。

在本实验中，Syntaxin 的理论分子量是 30 kD，而通过 SDS-PAGE 分析表明 Syntaxin 的分子量是 35 kD，之所以造成 Syntaxin 重组蛋白大小出现差异的原因前人早有分析[14]，推测可能是pET-28(+) 上的 His- 标签对重组蛋白产生影响，导致分子量和理论值出现差异。

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Construction and characterization of normalized full-length cDNA library and gene cloning of Syntaxin from Ornithogalum saundersiae

CHEN Xi, WANG Zhi-biao, TANG Wei, WANG Wei, CHENG Ke-di, KONG Jian-qiang

Objective Construction of Ornithogalum saundersiae EST library to facilitate the gene screening and functional characterization. Methods The total RNA of Ornithogalum saundersiae was isolated by CTAB method. A normalized full-length cDNA library, with titer of above 3 × 106cfu/ml, was established by the method of SMART using the total RNA of young bulb of Ornithogalumsaundersiae as the template. Sequencing analysis of 1440 clones, which were selected randomly from the constructed EST library of Ornithogalum saundersiae was performed. Blast analysis (NR, NT, Swiss-Prot and KEGG) and COG function classification were done using the acquired EST sequences.Results The average size of cDNA inserts was 1500 bp with a redundancy rate of 3.3%. Meanwhile a total of 1146 unigenes were attained by sequencing. These results indicated that the normalized full-length cDNA library was established successfully. Two cDNA sequences, similar to Syntaxin gene, were screened from cDNA library. Blast analysis showed the two sequences were probably the 5' and 3' sequence of the same Syntaxin gene. Two pairs of primers based on the specific Syntaxin gene were synthesized. The full-length Syntaxin gene was isolated from Ornithogalum saundersiae by standard RT-PCR. The Syntaxin gene was cloned into the E.coli expression vector pET-28a(+) and the recombinant E.coli containing Syntaxin gene was induced to express by IPTG addition. SDS-PAGE and Western blot results indicated that the Syntaxin gene was successfully expressed in E.coli.Conclusion The Ornithogalum saundersiae EST library was successfully constructed. A full long cDNA similar to Syntaxin gene was isolated from Ornithogalum saumdersiae and then heterologous expression in E.coli was performed successfully, which laid the foundation for further functional characterization of Syntaxin gene in the future.

Gene library; Qa-SNARE proteins; Ornithogalum saundersiae

KONG Jian-qiang, Email: jianqiangk@imm.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.002

天然药物活性物质与功能国家重点实验室优秀青年人才基金（B-2011-4）

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室/卫生部天然药物生物合成重点实验室（陈茜、王志标、王伟、程克棣、孔建强）；430071 武汉大学基础医学院（陈茜、唐微）

孔建强，Email：jianqiangk@imm.ac.cn

2013-03-15

方法 CTAB 法提取虎眼万年青鳞茎总 RNA，通过SMART 方法构建全长 cDNA 文库，获得库容大于 3 × 106cfu/ml 的均一化全长 cDNA 文库。随机挑取 1440 个单克隆测序，并对得到的 EST 序列进行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG）以及 COG 功能分类。

结果 获得 1398 条有效 EST 序列，含有 1146 条单一基因，cDNA 文库平均插入片段长度在 1.5 kb 以上，全长率54%，冗余率 3.3%。其中两段基因都与 Syntaxin 43 基因相似，同源性分别为 76% 和 89%，根据 Blast 比对结果，推断这两个基因片段是同一个 Syntaxin 基因的 5' 端和 3' 端。据此设计引物，以虎眼万年青 cDNA 为模板，通过常规的 RT-PCR 扩增得到全长 Syntaxin 基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体，接着导入大肠杆菌进行诱导表达，SDS-PAGE 和 Western blot 证实该基因在大肠杆菌获得表达。

结论 首次构建成功虎眼万年青 EST 文库；并从中筛选得到一条和 Syntaxin 具有同源性的基因，实现了 Syntaxin 蛋白在大肠杆菌中的表达，为 Syntaxin 基因功能的鉴定奠定基础。

Author Affiliations: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products, Ministry of Health of PRC, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (CHEN Xi, WANG Zhi-biao, WANG Wei, CHENG Ke-di, KONG Jian-qiang); School of Medicine of Wuhan University, Wuhan 430071, China (CHEN Xi, TANG Wei)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(4):247-253