胎盘源间充质干细胞的分子生物学特性

王敬龙 金巨楼 杜冰 毛智 王树平 刘志辉

胎盘来源的间充质干细胞（placenta derived mesenchymal stem cell，PMSC）是近几年来受到学者普遍关注的一种新的成体干细胞。胎盘，这一在胎儿娩出后被“废弃”的人体器官，不仅来源丰富、取材方便、产妇知情同意后无伦理限制，而且具有造血支持及免疫抑制等诸多优点，使PMSC成为间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）中倍受关注的一种。随着对PMSC研究的深入，笔者发现其分离培养方法多种多样，莫衷一是，对其生物学性状的阐述也不尽相同。鉴于此，本文对PMSC的分子生物学特性做一综述。

一、PMSC的来源

MSC来源于发育早期的中胚层和外胚层，而胎盘的主体部分为羊膜及绒毛膜中胚层，提示胎盘为MSC很好的生物来源。Zhang等[1]讨论了MSC在胎盘中的存在。人胎盘是一种由胎儿组织与母体组织共同组成的器官，羊膜和绒毛膜来源于胎儿，蜕膜则起源于母体，所以研究胎盘的细胞存在应区分其不同来源。苗宗宁等[2]研究显示脐带附着处下方胎盘组织相对于其他部位更易获取较多的MSC。In′t Anker等[3]首先报道了中期妊娠羊水是 MSC临床应用的含量丰富的来源。对比羊水来源以及羊膜来源的MSC发现，二者的生长特点及生长曲线相近。这些现象一方面说明胎盘中的确存在MSC，另一方面提示羊水中MSC极有可能来源于羊膜等实体组织。Miki等[4]研究证实羊膜上皮细胞具有干细胞特性并表达干细胞标志基因。

另外，取材部位的不同将影响所获取的MSC的数量及其增殖分化能力[5]。目前研究的PMSC，多是指胎儿面的PMSC，即羊膜和绒毛膜部位的细胞，但也有人报道了对母体来源的胎盘细胞即蜕膜部位的细胞的研究，认为其具有多能性、肌纤维母细胞性、来源广、保存容易等特点[6-7]。

二、PMSC的分离方法

由于胎盘的结构特殊、功能多样、细胞成分复杂，包括各种滋养细胞、间充质细胞、Hofbauer细胞及各种血细胞等，因此在分离培养过程中受其他细胞干扰的情况严重。目前常用的PMSC分离方法主要有酶消化法、组织块培养法和整体灌注法。

1.酶消化法：酶消化法应用最为广泛，常使用的酶消化法是先将组织剪碎，用酶消化后制成细胞悬液，再以密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪分选法或磁珠分选法进行分离。由于PMSC表面标志不够特异，应用流式细胞仪分选法或磁珠分选法会造成大量细胞损失，且成本高。贴壁筛选法是利用PMSC贴壁生长的特性，通过贴壁培养及传代，使细胞逐渐得到纯化。密度梯度离心法则是利用细胞密度的差别，分离出密度在一定范围内的细胞[8]。由于胰蛋白酶是通过离解细胞间的黏蛋白和糖蛋白来破坏细胞骨架，从而使细胞分离，因此会对细胞活力产生一定的影响。而胶原酶主要离解细胞间质的脯氨酸-中性氨基酸-甘氨酸-脯氨酸多肽，对间质细胞影响较小[9]。PMSC消化所用的酶通常为胶原酶Ⅱ或Ⅳ，目前大多数实验都采取胶原酶Ⅳ进行消化。陆琰等[8]研究显示，使用胶原酶Ⅱ消化胎盘组织，结合羟乙基淀粉沉淀法能更好的分离PMSC。Bailo等[10]用胰蛋白酶、离散酶、DNA酶及胶原酶多次重复消化，促进细胞游离以达到获得MSC的目的。

2.组织块培养法：该方法将组织剪碎后不经过酶处理，直接放在培养皿中使其贴壁生长。为提高细胞富集效率，Fukuchi等[11]采用外植胎盘组织块法促进细胞贴壁；In′t Anker等[12]用 10 cm2羊膜或10 cm2蜕膜组织采用培养基中添加内皮细胞生长因子及1﹪明胶包被培养板法，成功分离获得MSC。李栋等[13]研究显示，组织块培养法虽然简便易行，但其弱表达CD29和CD105，仅能向脂肪细胞分化。而酶消化法所得细胞符合MSC特征。但同时有其他研究表明[14]两种方法得到的PMSC表面标志表达率差异无统计学意义。且组织块培养法较酶消化法节省了消化组织等步骤，大大节省了操作时间，不仅避免了长时间酶消化对细胞的损伤，也避免了由于长时间操作而导致污染几率增加的危险。目前两种方法没有定论，实验多采用酶消化法，具体优劣需随着时间的推进加以印证。

3.整体灌注法：张毅等[15]用含肝素钠的IMDM经脐血管循环形成灌流途径，去除胎盘内残留的脐血，然后在无菌条件下将胎盘置于培养基中室温浸泡过夜，采用密度梯度离心法从组织浸出液中分离液获得MSC，这种方法得到的MSC大小均匀，纯度较高。李芳等[16]以D-Hank液灌注，在一定的压力作用下，首先去除红细胞干扰，其次破坏血管内皮结构，暴露内皮下组织。收集培养的细胞即来自血管内皮以及内皮下组织。流式细胞术鉴定其表面标志以及多向诱导分化的实验结果与酶消化分离培养的PMSC相同，并且生长速度更快，PMSC纯度更高。由于灌注后获取的细胞数量多，且成分相对单一，所以培养后PMSC纯度高，其它细胞干扰较少。但需要胎盘组织完整不能有破损然而胎盘组织体积大，无菌操作要求更高，所以整体灌注的方法有待于进一步优化。

三、PMSC的生物学特性鉴定

1.表面标志及基因表达：目前各学者对PMSC表面标志的鉴定多集中在整合蛋白家族CD29、透明质酸受体CD44、间质细胞标志CD73、CD105以及 CD166，SH-2/CD105，SH-3，SH-4的高表达上[8，14，16，17，18]；此外，绒毛膜来源 MSC 还表达某些多潜能转录因子，如Sox-2、Nestin；CD106可有高表达、低表达或不表达，不表达造血细胞标志CD34、CD45、CD14、HLA-DR和内皮细胞表面标志vWF、Flk-1、CD31以及特殊滋养层细胞的表面标志等。Bailo等[10]对羊膜及绒毛膜细胞进行生物学特性的研究发现，羊膜及绒毛膜细胞共同表达的表面标记为 CD105，CD44，CD90，CD54，CD73，CD29。令人感兴趣的是，PMSC可以表达某些胚胎干细胞的表面标记如SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81，提示PMSC可能是非常原始的细胞群，具有更广泛的自我更新和多系分化能力。另外有学者还进行了一系列细胞表面共刺激因子的检测，发现包括 CD80、CD86、CD40/40L、B7/CD28、ICOS、4-1BB等在内的共刺激分子在PMSC均不表达，表明PMSC免疫原性很低[19-20]。Fukuchi等[11]也用RT-PCR技术分析培养了2～18代的PMSC的不同基因，结果显示其基因表达与骨髓来源的MSC很相似，可同时检测出3个胚层的基因表达即器官特异性基因表达、造血内皮基因表达、干细胞标志基因表达。Parolini等[21]提出了鉴定PMSC的最基本标准即贴壁生长，成纤维样细胞形成菌落的能力，表达基本的特异性表面标志，如CD90、CD73、CD105，不表达 CD45、CD34、CD14和HLA-DR，向一两个谱系的细胞分化的能力，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、胚胎起源的细胞等。

2.生长曲线及细胞周期：通过其生长曲线测定，传代后潜伏期约为 24～48h，细胞倍增时间约为36～48h，细胞周期分析显示，仅少数 PMSC 处于分裂期，约95﹪的细胞处于G0/G1期。这一部分细胞保留自我更新和增殖能力，符合干细胞特性[22]。

3.多向诱导分化能力：因骨组织、脂肪、软骨主要来源于中胚层，所以体外诱导间充质干细胞分化为骨、脂肪及软骨的能力可能是细胞鉴定最基本和最关键的要求[5]。刘春丽等[23-25]通过实验证实PMSC在特定诱导环境下不仅可以向成骨细胞及成脂肪细胞定向分化，而且在内皮细胞诱导培养基内可以向创伤修复细胞——内皮细胞定向分化。有研究表明PMSC也可向外胚层细胞如神经细胞、神经胶质细胞和类神经性细胞、心肌细胞及肝细胞分化[26-27]。

4.免疫抑制特性：由于胎盘来源的MSC一般不表达HLA-DR抗原，说明PMSC是免疫原性极低的细胞[28]。将羊膜及绒毛膜细胞移植入新生的猪和鼠体内，通过两种人重复DNA区域进行检测发现这两种动物体内多个器官都可检测到微小嵌合体[10]，说明PMSC不仅具有低免疫性，而且可以抑制其他细胞引起的免疫反应，即具有免疫抑制性。围绕免疫抑制的机制存在很多的争论，如诱导CD8+T细胞凋亡学说、Fas受体学说和剂量依赖学说等[29-31]。以上这些机制都没有定论，有可能是共同作用使PMSC具有免疫抑制性。

四、PMSC与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的比较

BMSC具有多向分化潜能，是组织工程、细胞移植和基因治疗中研究的热点。在细胞形态、贴壁生长、表达CD29、CD105、CD166和不表达CD34、CD45、CD80、CD86及HLA-DR等方面，PMSC和BMSC生物学特性表现相同或相似[32]。BMSC体外培养方法简单，增殖速度快，但成人BMSC含量低，随着年龄增加其数量及增殖分化能力会随之衰退，且多次取材对患者有损伤，这些都限制了BMSC在基础及临床上的应用。相反，PMSC易分离培养，增殖迅速，可以向多种组织细胞分化。与捐献骨髓或采集动员外周血相比，供者无痛苦，感染机会少。利用骨髓提取干细胞，受者的血型必须与骨髓捐赠者非常接近，才能不产生排斥反应，而PMSC则具有免疫调控的作用[10]。PMSC的增殖速度更快，而且更具长期生长的能力。另外，胎盘可以抑制细胞间相互刺激引起的T淋巴细胞增殖的现象，因此PMSC是脐带血来源的造血干细胞体外培养的最佳滋养层细胞，对其有肯定的体外支持和扩增作用，而且PMSC的造血支持作用优于BMSC[15]。通过对近几年国内外有关于PMSC研究的文献回顾，我们总结PMSC较其它来源成体干细胞有如下优点：（1）取材几乎不受限制，具有产业化应用前景；（2）PMSC具有发育上的原始性，较之其他组织类型来源的成体干细胞具有更好的自我更新和多向诱导分化能力；（3）不会给患者造成不必要的恐慌和继发医源性损害；（4）具有正常的染色体核型，致瘤实验阴性，说明其遗传性状稳定、安全。

五、临床应用及展望

人PMSC作为一种良好的“种子细胞”来源，它可以对受伤或病变的多种组织器官加以修复和重建。Ichim等[33]发现输注入PMSC后可抑制心肌炎症、抑制心肌细胞的凋亡、刺激血管增生，并可观察到对扩张性心肌病有一定的疗效，这些研究对心衰的细胞学治疗有巨大的贡献[34]。人羊膜上皮细胞体外定向分化的肝细胞可以表达至少30种人成体肝脏所表达的基因，这说明人羊膜上皮细胞来源的肝细胞对肝脏疾病可进行有效的治疗[21]。将羊膜上皮细胞移植入脊髓损伤小鼠模型的受损部位后观察到功能逐渐改善，用大鼠脊髓损伤评分系统评估小鼠后肢能力，最后达到19分，比正常动物的比分仅低2分[35]。Liu等[24]报道了PMSC具有促进创伤愈合的作用，并具有向创伤局部扩充归巢，向创伤修复细胞——内皮细胞定向分化的作用；还可作为VEGF的载体细胞，运载目的基因到达靶区域发挥VEGF的长效促愈功能。王博蔚等[36]通过研究发现多药耐药基因mdr1逆转录病毒载体可有效转染PMSC，转染的外源基因不但可充分表达，也可发挥正常的生理功能。

综上所述，PMSC既有和其他来源MSC相似的生物学特征，同时在某些生物学特性方面有着其他来源MSC不具备的优势，是一种极具开发和研究价值的“种子细胞”。

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