关节软骨细胞在软骨修复中应用新进展

郭振业 卫小春 段王平

关节软骨损伤是人类面临的主要运动性疾病之一，常由创伤、软骨骨炎、骨性关节炎等引起。一直以来，关节软骨缺损的修复是骨科基础研究中的难点。随着中国社会人口老龄化和运动创伤的增加，关节软骨缺损发病率呈日益增加的趋势。关节软骨一旦损伤，则遗留永久性病变，且软骨组织自愈能力非常有限，治疗比较困难，常常影响人们的正常生活。现从关节软骨的结构和功能、组织工程的种子细胞及修复机理等方面阐述国内外在软骨细胞修复领域的研究进展。

一、关节软骨的结构及功能

软骨是一种高度分化的结缔组织，由软骨组织及其周围的软骨膜构成。人体正常软骨呈透明白色，质地光滑，周缘整齐规则，厚度约为 3～7 mm，通常关节软骨可分为表层和固有层。成人的关节软骨固有层一般又分为4层，即：表层、移形层、辐射层与软骨基质钙化层，也有学者把钙化层与软骨下骨总称为软骨下骨板。软骨下骨板不仅起支持作用，而且还参与软骨与骨髓腔之间的营养交换[1]。软骨基质的主要成分是蛋白多糖、胶原纤维和水份，水份占70﹪～80﹪，蛋白多糖和胶原纤维各占10﹪～15﹪[2]，还有很少一部分糖蛋白、脂肪、蛋白质及无机盐。Mayne[3]发现关节软骨内存在有Ⅰ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅵ型胶原纤维，关节软骨内胶原属Ⅰ型，它不形成大的纤维束，原纤维较细，缺乏交叉连接的形式，这些特点使原纤维容易散开，增进了组织内原纤维与蛋白多糖的并列排列，以适应关节功能。经过研究，关节软骨并无血供神经调节，所以它的营养成分来源便成了问题，只靠关节滑膜分泌的滑液，并且通过关节面之间的挤压力进入软骨，可见其营养来源单一，供给困难。也有专家学者指出，关节的运动能使滑液中的营养成分挤压进入软骨中，例如髌骨营养小循环说，它为关节软骨发病原理和软骨损伤提供了依据[4]。

二、关节软骨的损伤与修复

1.关节过度活动引起劳损：运动训练安排不当、长期大运动量、关节强负荷可引起关节软骨软化已是不争的事实，这类损伤是长期逐渐劳损、磨损和细微损伤累积而致[5]。关节损伤常见两种情况：（1）关节急性损伤引起关节软骨的损伤：一次性的关节扭伤、挫伤等也常引起关节软骨的损伤，据报道，成人关节软骨修复能力有限，创伤直径大于3 mm 即不能自我修复[6]；（2）缺乏运动：关节活动对关节软骨形成有重要作用。邱宜兴等[7]将家兔分成膝关节作90°屈曲功能位和伸直位固定两组，前组动物12周后软骨才有轻度改变，而后组4周时动物已有软骨退行性变形成，由此可见，关节适当活动是维持关节软骨生理机能的重要条件。

2.关节软骨损伤的自发修复：关节软骨由于无血管，其损伤后的修复反应根据是否穿透软骨下骨板而不同。成熟的关节软骨增殖能力差，软骨细胞在软骨陷窝内，且周围基质稠厚，限制了软骨细胞的迁移[8]。软骨损伤破坏了软骨下骨板，骨髓内的间充质干细胞（mensenchymal stem cell，MSC）、炎症细胞以及多种因子进入损伤区，损伤主要由纤维样软骨修复。滑膜细胞也有可能参与未穿透软骨下骨板，损伤周围软骨细胞向软骨缺损处迁移，修复损伤组织[9]。

3.关节软骨损伤组织工程修复：软骨组织工程是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并且以较高浓度将其种植于具有良好的生物相容性和降解性的合适支架材料上构建组织工程软骨，然后，植入组织缺损部位，完成组织的修复和重建。

三、关节软骨种子细胞

种子细胞是组织工程三大要素之首。组织工程化关节软骨在很大程度上依赖于种子细胞的选择。研究用于组织工程软骨的种子细胞有软骨细胞、骨膜细胞、滑膜细胞、胚胎干细胞、MSC等。

1.软骨细胞：自体软骨细胞是最好的软骨组织工程细胞来源，可以避免免疫排斥反应[10]。但自体软骨细胞取自人体正常组织，来源受限，且需要行二次手术。在体外单层培养时增殖能力较低，经过传代培养易发生去分化，蛋白聚糖表达减少，胶原表达由Ⅱ型转向Ⅰ和Ⅲ型，所以难以从少量组织经体外培养扩增来获得大量有正常功能的软骨细胞，限制了其临床应用[11]。软骨组织的结构有其特殊性，它本身不含血管、淋巴管和神经，可以分泌血管抑制因子，并且位于软骨囊包裹的软骨陷窝内，不易引起机体的免疫反应和排斥反应[12]。因此，同种异体软骨细胞可以作为软骨种子细胞的重要来源。应用同种异体软骨细胞作种子细胞已在具有免疫力动物体内成功形成同种异体组织工程化软骨，未发现明显的免疫排斥反应[13]。大量研究结果已经证明，同种异体软骨细胞可在受体内长期生长，并且保持分泌基质的功能[14]。与自体软骨细胞相比，同种异体软骨细胞具有来源广泛，取材容易，易于大量培养等优势。临床上可考虑收集截肢患者或新鲜尸体以及流产胎儿的关节软骨作为来源。

2.胚胎干细胞：胚胎源性细胞胚胎软骨细胞免疫原性小，并且细胞生长活跃，增殖较快。研究表明，胚胎来源的软骨细胞比成体系统的软骨细胞有更强的增殖能力，并且引起的异体排斥反应要微弱得多[15]。有报道，以其作为种子细胞修复关节软骨缺损获得了良好的效果，没有引起明显免疫排斥反应，修复组织也未见明显退变，可能是构建异体软骨组织工程较好的种子细胞来源[16]。胚胎干细胞由于其独特的高度未分化特性以及所具有的发育全能性，可以无限增殖，并且分化成全身所具有的200余种细胞类型，从而，有望形成机体的任何组织或器官。因而，近年来引起组织工程学家的极大关注，有望成为组织工程中种子细胞的新来源。Kramer等[17]用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和蛋白-4(BMP-4)作为调控诱导因子，在体外成功地诱导胚胎干细胞分化为软骨细胞。但其来源及其伴随的伦理问题是限制其应用的最大问题。

3.MSC：MSC来源于骨髓、骨膜、软骨膜、肌腱等处，是目前公认的最具有应用前景的种子细胞，可向骨、软骨、肌腱、脂肪等多种组织分化[18]。在一定诱导条件下(与软骨细胞共培养或通过给予适当的生长因子) 可向软骨方向分化，并且增殖能力强，许多实验已证实，MSC分化的细胞具有软骨细胞形态和分泌软骨特异基质的能力[19]。骨髓来源的间充质干细胞取材方便，操作简单，并发症少。成人一次骨髓穿刺2ml后体外培养3代以上，细胞数量可达到100万倍以上，并且仍保持多向分化潜能[20]。尹战海等 用rhTGF-B1、rh IGF-1体外诱导兔自体骨髓来源的间充质干细胞细胞增殖并向软骨分化，与同种异体BMG结合后在体外成功构建了组织工程软骨[21]。Kuroda等[22]应用兔自体骨髓来源的间充质干细胞细胞体外与TGF培养24 h，再与无细胞基质共培养24 h后植入兔膝关节，术后24周形成成熟关节软骨，且形成的组织与周围正常关节软骨结合良好。此外，有研究表明，脂肪干细胞[23]、肌源性干细胞[24]也具有成软骨作用。MSC研究还处于探索阶段，有很多问题有待解决，如MSC的分离纯化以及增殖、定向分化。MSC的增殖分化控制需要合适的条件，如何既控制增殖又能在适当的时候启动向所需的路径分化有待进一步的研究。

四、软骨细胞体外培养的影响因素

细胞生长依赖于其所存在的微环境。组织工程软骨细胞植入体内前，要在体外进行扩增。由于生长环境的改变，软骨细胞容易发生功能老化和表型的去分化，因此，体外的培养环境对软骨的正常生长非常重要，软骨细胞的生长分化主要受生长因子和机械生物力学信号的双重调节。

1.生长因子对组织工程关节软骨生长的影响：软骨组织含有多种生长因子，它们通过自分泌或旁分泌的方式在软骨分裂、生长和分化中起着重要的作用。用于软骨组织工程的生长因子主要包括：转化生长因子B超家族(TGF)、成骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等[25]。目前，细胞因子在软骨组织工程的研究主要集中在种子细胞的诱导方面和促进软骨细胞增殖及保持表型方面。在用细胞因子进行种子细胞的诱导研究中，由于种种限制，多局限于几个浓度点的实验。有研究[26]显示，TGF-B1体外分别在1、10、50、100mg/L时都可诱导MSC向软骨方向分化，但是在10mg/L时作用最佳。在一定范围内，生长因子的作用具有剂量依赖性，当超出此范围作用就不明显了。软骨细胞具有多种生长因子的受体，不同的生长因子可能作用于不同的生长周期，一种生长因子可以调节其他生长因子的表达和活性。Indrawattana等[27]研究显示，BMP-6或IGF-1单独应用不能诱导MSC向软骨方向分化，但是与TGF-B3合用时，较单用TGF-B3能更有效的诱导MSC向软骨方向分化，通过病毒或非病毒载体介导基因转染软骨细胞可使其分泌特定的生长因子。Madry等[28]将人IGF-1基因转染入关节软骨细胞，并且种植在多聚物支架上，与对照组相比，转染组的细胞数和新生组织厚度有明显的提高。Hidaka等[29]通过腺病毒将人BMP-7 基因转入牛关节软骨，体外培养3周，形成软骨厚度及Ⅱ型胶原和蛋白聚糖较对照组高。这一方法可以克服生长因子半衰期短的弱点，提高其运用于组织工程的效果。Liu等[30]发现软骨细胞基因转染后，细胞特有的表型(如Ⅱ型胶原和蛋白聚糖)减少或消失，并且基因转染的软骨细胞是否具有致癌性目前还存在争议，需要进一步研究。近年，对生长因子在软骨增殖过程中的作用开展了广泛的研究，但阐明多因子的复合作用及因子之间的相互影响仍是一个尚待解决的问题。

2.机械生物力学对组织工程关节软骨生长的影响：正常关节软骨组织的生长、演变是在一个封闭的力学环境中进行的。压力引起软骨一系列生理变化，包括细胞及细胞外基质成分变形、组织内液体流动、水流电位和生理生化变化，这些变化直接调控细胞外基质代谢。Kobayashi等[31]对一个3 mm 直径培养板内软骨细胞施加一定频率和振幅的动态压力，显示0.002～0.01 Hz的动态压力刺激培养软骨细胞合成细胞外基质，而静态压力则可引起细胞轻微的生物合成下降。在Ohyabu的研究中，牛的软骨细胞传代培养7代发生去分化，然后，重悬后种植于胶原支架上，在微重力生物反应器和静态培养2周，生物反应器内已去分化的软骨细胞再分化，分泌Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 ，机械刺激还可促进MSC向软骨方向分化[32]。因此，力学环境对培养软骨细胞生长、分化和表型的表达有非常重要的作用。但是，力学刺激怎样从胞外传到胞内，研究发现，整合素在介导细胞内外信号传导中起着重要作用。整合素是一组异二聚体的转膜糖蛋白，由一个A亚单位和一个B亚单位组成。整合素通过特殊分子结构将细胞外基质与细胞内骨架蛋白相连，将细胞外力学信号转化为细胞内生化信号，进而引发相应的生理病理改变。实验显示，软骨细胞体外培养给予循环压力后，可引起整合素A2和A5亚单位mRNA表达的升高，说明整合素在应答力学刺激中起重要作用[33-34]。

3.其他影响因素：软骨细胞的种植密度、代次、培养液以及氧浓度对它的增殖也很重要。细胞的高密度培养，可以促进细胞与细胞的相互作用，具有较高的细胞外基质合成率，并且能促进软骨细胞表型的表达[35]。在同样条件下的体外单层培养，当种植密度大于5×106/ml时，软骨细胞的分化率显著高于1×106/ml，而小于1×104/ml 时，软骨细胞难以成活而死亡[36]。传代培养(第2～4代)的软骨细胞相对接种存活率和生长活性高于原代培养者。氧浓度对于软骨细胞和胶原的合成有明显的影响。Szodi等[37]认为，氧的浓度在12﹪～25﹪ 最好，在 12﹪～45﹪ 之间没明显的差异，但在高浓度90﹪和低浓度1﹪～5﹪的情况下，会抑制软骨及Ⅱ型胶原的形成。软骨细胞的生长对培养液 pH值也很敏感，pH 值在7.0～7.2 时，细胞代谢旺盛。

五、关节软骨细胞临床应用

关节软骨的生物学研究已经证实，由于软骨组织结构特殊——无神经、血管、淋巴管。幼年关节软骨可由软骨下通路获得部分营养，而成年关节软骨没有软骨下营养通路，软骨的营养供给是通过关节活动产生的压力变化，使滑液在关节腔与软骨基质之间进行交流[3,38]。但是随着近年来各个科学领域的突飞猛进，有很多关节缺损修复术被渐行渐用起来。一种是软骨细胞移植，用于移植的细胞主要有自体软骨细胞、异体软骨细胞和MSC等[39]。随着细胞生物反应器培养技术的发展，以及软骨细胞永生化研究的深入，在一定程度上解决了供体细胞的来源和去分化问题，单纯游离的细胞移植容易导致流失，所以移植一般都联合了其他方式。在临床上有人应用自体软骨细胞移植修复年轻人创伤性软骨缺损[40]。Buschmann等[41]将自体软骨细胞移植的方法治疗7例髌软骨缺损，2例疗效优良，治疗16例股骨髁部软骨缺损，14例疗效优良。可是现在移植包埋使用的基质常为人工合成，所以有科学家认为人工合成的基质在一定程度上会破坏细胞生长的微环境，使表现性软骨细胞欠表达。还有报道指出自体软骨移植，Gautier等[42]研究了100例关节软骨损伤的患者，其中42例为马赛克骨软骨受损，58例自体软骨细胞移植。后跟踪随访两年，随访结果显示自体移植优于马赛克骨移植。另一种骨软骨移植的方式适用于较大面积软骨缺损和缺失深度达软骨下骨的治疗。自体软骨移植效果好 ，但是供体来源很少，异体软骨移植供体充分，但增加了其他传染病的风险 ，由于软骨中免疫细胞含量很少，所以软骨移植引发的排异反应较小[43]。

组织工程修复关节软骨缺损目前主要处于动物实验阶段，应用于临床的是自体关节软骨细胞移植修复关节软骨缺损。Henderson等[44]对53例患者随访2年回顾性研究报道，缺损大小在1～7.5 cm2（平均 3.7 cm2）范围，对患者进行临床评价、核磁共振检查以及关节镜复查、组织活检等检查，术后2年临床症状明显改善的在86﹪以上，核磁共振显示新生组织为透明样软骨影像，接近正常影像97﹪，关节镜复查缺损处生成透明样软骨，但活检显示软骨基质含量、细胞数量及排列等均与关节透明软骨仍有明显差别。100例患者随访2～9年（平均3年11个月），术后90﹪患者可参加高水平体育活动，关节镜复查修复处生成透明样软骨。

六、总结

近年来，国内外诸多不同学科专家已对关节软骨组织工程各方面进行了大量研考，并取得了丰硕成就。但是，仍然有许多问题亟待解决：（1）例如种子细胞的选择及体外培养体系的不稳定性；（2）构建的支架材料是否理想；（3）形成的软骨组织力学性能差，与宿主组织溶合不好，后期容易退化；（4）生成的软骨细胞表型改变，胶原和蛋白聚糖存留很少；（5）对修复的分子机制掌握不全面；（6）组织工程修复软骨损伤目前主要处于动物实验阶段，软骨缺损人为产生，没有体内代谢异常，而临床上，软骨损伤少数由外伤引起，无体内代谢异常；（7）大多数（骨性关节炎、类风湿性关节炎等）除局部软骨病变外，都有全身代谢异常。在构建软骨修复动物模型时，需要考虑体内代谢异常对软骨修复的影响，可以在骨性关节炎基础上构建软骨组织工程模型，模仿体内软骨损伤，更好的评价组织工程修复软骨损伤的效果。随着科学的发展，有理由相信，通过努力，软骨组织工程的研究不仅可以为临床上多见的软骨疾病和缺损的治疗开辟新的途径，而且对整个组织工程的进展必定会起到巨大推动作用。

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