大豆提取液中大豆黄素的紫外分光光度测定法

蒋盼，顾建明

（上海大学生命科学学院，上海200444）

异黄酮（isoflavone）在自然界中的分布只局限于豆科的蝶形花亚科等少数植物中，其中含量较高的有苜蓿、红三叶草和大豆（Giycine max（L）Merrill）。大豆异黄酮主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少，是大豆生长过程中形成的次级代谢产物，属黄酮类中的异黄酮多酚化合物，是大豆中主要的生理活性物质。在大豆中存在十二种异黄酮，按照结构可以分为四类：游离型异黄酮苷元（aglucone）、葡萄糖苷（glucoside）、乙酰基葡萄糖苷（acetylglucoside）和丙二酰基葡萄糖苷（malonylucoside）。其中对人体的起主要生理作用的是游离型异黄酮苷元[1-5]：染料木素（genistein），大豆黄素（daidzein），黄豆黄素（glycitein）。

近年来，动物实验、体外实验以及临床实验的研究表明，大豆异黄酮对人体具有保健功能，主要有：（1）雌激素样作用，由于其结构与女性雌激素内源雌二醇相似，能维持女性雌激素水平的平衡，缓解妇女更年期综合症[6-7]；（2）预防骨质酥松症[8-9]；（3）调节血脂以及抗动脉粥样硬化[10-11]；（4）抗氧化活性[12-13]；（5）缓解心血管疾病[14]；（6）抗癌作用[15-16]等。

在日常生活中，大豆制品是人们摄取大豆异黄酮的主要膳食来源，研究表明，加工过程会造成大豆异黄酮的显著损失，其中，浸泡使12%的大豆异黄酮流失于浸泡水中；凝固使44%大豆异黄酮丢失于乳清溶液中[17-18]，这些含保健功能物质的废弃排放物也污染了环境，因此，豆制品加工过程中大豆异黄酮的回收利用具有研究价值。

目前检测大豆异黄酮常用的方法[19]有紫外分光光度法和高效液相色谱法。高效液相色谱法灵敏、重现性好，但需要专门的人员操作维护，成本高。紫外分光光度法简单、方便、快速但精密度低。本实验旨在通过研究大豆提取液中大豆黄素的紫外分光光度和HPLC测定结果间的差异，建立一新的准确的大豆黄素的紫外分光光度测定法。这对工业化豆制品加工生产中准确、方便、快速检测、回收和利用大豆异黄酮资源都具有十分重要的意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

黄豆（当地超市购买）；甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），浓磷酸（分析纯，≥85%），BHT（色谱纯，purity≥99%）；大豆黄素（daidzein，purity≥99%）购自田同生化技术有限公司。

UV-754紫外可见分光光度计，恒温干燥箱，水浴锅，YXJ-1 型低速离心机，AB104（METTL ER-TOLEDO Group，Max101g，d=0.1mg） 电子分析天平，LC-20A（SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、LC-20AT泵）高效液相色谱仪：日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆黄素紫外吸收波长的测定

准确称取大豆异黄酮标准样品大豆黄素5 mg，甲醇溶解后，定容于50 mL容量瓶中，配置成0.1 mg/mL的母液。在199 nm～400 nm紫外区扫描。4℃下保存[20]。

1.2.2 标准曲线的绘制

1.2.2.1 高效液相色谱法

准确吸取 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 1.2.1 中配置的母液于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配置成1、2、4、6、8、10 μg/mL 的标准品溶液。用 Ф13 mm，孔径为0.45μm的有机针孔过滤器过滤于进样瓶中，在色谱柱CLC-NH2（Ф6 mm×150 mm），流动相：V乙腈∶V0.001%磷酸=28∶72，流速 0.7 mL/min，柱温 40 ℃，检测波长 230 nm条件下，进样10 μL进行测定，绘制浓度与峰面积的标准曲线。

1.2.2.2 紫外分光光度法

将1.2.2.1中的大豆黄素标准溶液用UV-754紫外可见分光光度计在特定波长下测定吸光度值A，其中波长为1.2.1扫描图中读出的最大吸收波长，绘制浓度与吸光度值的标准曲线。

1.2.3 样品的制备和测定

压制黄豆至厚度为0.35 cm，称取50 g于烧杯中。往烧杯中添加水（第一次加120 mL，以后每次加100 mL），置50℃水浴中，每隔20 min收集一次浸泡液，重复10次。收集浸提液后，4℃下保存。

取20 mL浸提液，加入25 mL甲醇溶液，50 mL，4 mol/L盐酸溶液，0.75 g BHT。44.6℃下水浴回流3 h，过滤，收集上清液，用甲醇定容至100 mL[21]。4℃下保存。取处理好的黄豆浸提液，在相同色谱条件下测定其大豆黄素的峰面积；在相同紫外波长条件下测定吸光度值。

1.2.4 紫外和HPLC测定方法的比较

将黄豆浸提液按表1准确稀释成6种不同浓度样品，该系列浓度涵盖UV和HPLC标准曲线的有效范围。在最大吸收波长下用紫外法测量它们的吸光度值A，根据1.2.2.2绘制的紫外标准曲线计算出各稀释样品的浓度值，每种稀释样品重复测定5次。同样也用HPLC法测得各稀释样品的浓度值，每种稀释样品重复测定5次。对每种稀释样品的紫外和HPLC测定值间进行差异性检验（t检验法）。

表1 黄豆浸提液样品的制备Table 1 Dilution factor of soy extraction sample

1.2.5 紫外法标准曲线的矫正方法

设HPLC标准曲线方程为YHPLC=k1XHPLC+b1，紫外标准曲线方程为Y紫外=k2X紫外+b2，矫正后的的紫外标准曲线为Y=kX+b，用表1中样品1和样品5紫外和HPLC测得的值代入矫正后的方程得下列二元一次方程组：

解此方程组，得k和b值，即可求得矫正后的紫外标准曲线方程Y=kX+b，再按1.2.4的测定程序，检测矫正后的紫外标准曲线测得值与HPLC测得值间是否存在差异。

1.2.6 精密度和准确度测定

准确吸取黄豆浸提液样品1 mL于甲醇定容至10 mL，在最大吸收波长下测定其吸光度值A，并根据1.2.5绘制的曲线计算其浓度，重复5次，计算RSD值。

取黄豆浸提泡液1 mL 6份于10 mL具塞试管中，再分别准确加入 1.2.2.1 中标准品溶液 1、1、1、2、2、2 mL，用甲醇定容至10 mL，混匀后在最大吸收波长下测定吸光度值A。根据1.2.5绘制的标准曲线计算大豆黄素的浓度值，按（测得大豆黄素量-原样品量）/加样量×100%计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 大豆黄素的紫外吸收波长

大豆黄素在248 nm处有最大吸收值，如图1。

2.2 两种测定方法的标准曲线

2.2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法测定结果见图2、图3、图4。

HPLC法测得的大豆黄素浓度与峰面积方程为y=104 835x+4 119.7，R2=0.990 9，浓度与峰面积呈较好的线性关系，大豆黄素的高效液相色谱标准曲线见图4。

2.2.2 紫外分光光度法

紫外分光光度法法测得的大豆黄素浓度与吸光度分别为y=6.959x-0.002 7，R2=0.997 7，浓度与吸光度呈较好的线性关系，如图5。

图5 大豆黄素UV标准曲线Fig.5 Daidzein standard curve between concentration and absorbency

2.3 两种方法测定样品浓度值的差异性及其矫正

表2选取列出了大豆浸提液稀释液样品2、4、6紫外法和HPLC法测得的浓度值和差异性，查表得t0.01，5=4.032 1，计算得出的 t均大于 t0.01，5，即用 2.2.2中的 UV和HPLC标准曲线方程测得的浓度值间存在极显著性差异，因此，需要对原紫外吸光度与浓度的标准曲线方程进行矫正。

表2 第2、4、6号样品紫外和HPLC测定值间的比较Table 2 The daidzein content difference by UV and HPLC（sample 2，4，6）

按照1.2.5中方法对原紫外法曲线进行矫正，得到新的紫外法标准曲线方程为y=0.706 1x+0.012 5（见图6）。采用此方程测得的大豆浸提液稀释样品浓度值与HPLC测得的值差异性分析见表3（表中仅列出稀释样品 1，3，5），t均小于 t0.01，5，UV 法与 HPLC 法测定值间已无显著性差异。

2.4 精密度和准确度

矫正后紫外法测定大豆黄素的精密度和准确度测定结果分别见表4和表5，平均回收率为99.128%。

表3 第1、3、5号样品紫外（矫正后）和HPLC测定值间的比较Table 2 The daidzein content difference by UV（corrected）and HPLC（sample 1，3，5）

表4 大豆黄素的精密度Table 4 Precision of daidzein detection

表5 大豆黄素曲线的准确度（×10-3mg）Table 5 Accuracy of daidzein detection（×10-3mg）

大豆浸提液中不仅含有大豆黄素，还含有黄豆黄素、染料木素等大豆异黄酮，这些黄酮类物质由于含有苯环，在248 nm处都有弱紫外吸收，这就构成了对用紫外法测定大豆黄素的含量的干扰。故需要对吸光度与浓度的曲线进行矫正，矫正所得到的标准曲线的准确度和精密度均较好。

3 结论

由于大豆提取液中存在许多影响大豆黄素的测定结果物质，如黄豆黄素、染料木素及其它在248nm有吸收的化学成分，从液相色谱法和紫外法测定的结果即可以看出。以液相色谱法测定的大豆黄素浓度值作为可信值，对紫外标准曲线方程进行矫正，得到新的紫外标准曲线方程y=0.706 1x+0.012 5，该方程可准确、快速、方便地运用于大豆提取液中大豆黄素的测定，该研究方法也可为其它大豆异黄酮的紫外测定所借鉴。

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