慢性髓系白血病PDLIM4 基因表达与其启动子甲基化水平的关系

李云，钱军，陈芹，姚冬明，王翠竹，柴海彦，杨静，林江，马吉春，陈星星，马玉娟

(江苏大学附属人民医院1.血液科，2.中心实验室，江苏 镇江212002)

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种起源于造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病。根据疾病发展的过程，分为慢性期、加速期以及急变期。CML 的发病与BCR/ABL易位引起的酪氨酸激酶异常激活密切相关［1]。PDLIM4 基因(PDZ and LIMdomain 4 gene)，又称RIL(reversion-induced LIM)基因，是定位于染色体5q31.1 的抑癌基因［2]，可抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡［3-5]。近年来研究发现PDLIM4 基因启动子甲基化与CML 疾病进展和伊马替尼耐药相关，且是CML 患者的一个不良预后因素［1]。我们应用实时定量PCR(RQ-PCR)及实时定量甲基化特异性PCR(RQ-MSP)技术检测了中国CML 患者PDLIM4 基因转录本及启动子甲基化水平，并探讨其临床意义。

1 对象与方法

1.1 病例

59例CML 患者均来自于我院门诊和住院部，均按文献［6]方法进行诊断和分期，均通过染色体和(或)融合基因检测证实。检测PDLIM4 表达和启动子甲基化状态的对照组均为特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者，病例数分别为21例和24例。

其中，用于检测PDLIM4 基因表达的36例标本包括33例慢性期及3例急变期患者。共有60例样本用于检测PDLIM4 基因启动子甲基化状态，其中59例初发(慢性期44例，加速期6例，急变期9例)，1例为经治疗随访患者的标本。

1.2 主要试剂与仪器

淋巴细胞分离液(Ficoll)购自上海试剂二厂;Trizol购自美国Invitrogen 公司;Evagreen 染料购自Biotium 公司;MMLV 及TaqDNA 聚合酶购自美国Fermentas 公司;基因组DNA 提取试剂盒为美国Gentra公司产品;pMD®19T 克隆载体为TaKaRa 公司产品;凝胶回收试剂盒及质粒DNA 小量试剂盒购自Axygen公司;DNA 甲基化修饰试剂盒EpiTech Bisulfite Kits购自德国QIAGEN 公司;引物均由生工生物(上海)有限公司合成。主要实验器材为ABI 公司的7300 定量PCR 仪，Bio-Rad 公司的iCycler 梯度PCR 仪以及Syngene 公司的Gene Genius 凝胶成像仪。

1.3 骨髓单个核细胞(BMNC)分离和总RNA、基因组DNA 制备

抽取患者及对照组骨髓10 mL，经肝素抗凝，通过Ficoll 液离心分离BMNC，取一部分用生理盐水洗涤后加入细胞裂解液Trizol，按常规操作进行RNA 提取及相应逆转录，所得cDNA 贮存于-20 ℃备用。另取BMNC，按试剂盒说明书提取基因组DNA，经紫外分光光度仪测光密度值来确定DNA 含量和纯度，立即硫化修饰处理或-20℃保存备用。

1.4 DNA 亚硫酸盐修饰

每份病例样本取1 μg DNA，依照DNA 甲基化修饰试剂盒说明书严格操作，将已完成亚硫酸氢盐修饰处理的标本置于-80℃保存备用。

1.5 PDLIM4 基因表达的检测

应用Primer Express 2.0 软件(美国ABI 公司)设计RQ-PCR 引物(表1)。据相关文献报道，选择ABL及ALU分别作为检测PDLIM4表达、甲基化的内参基因［7-8]。

表1 PDLIM4 基因RQ-PCR 与RQ-MSP 引物序列Tab 1 The primer sequences of PDLIM4 gene for RQ-PCR and RQ-MSP

25 μL RQ-PCR 反应体系包含dNTP 0.2 mmol/L，MgCl24 mmol/L、引物0.4 μmol/L、1 ×EvaGreen、1 ×Rox、1.0 UTaqDNA 以及50 ng cDNA。反应条件:94 ℃4 min 预变性，然后95 ℃变性30 s、62 ℃(ABL 为60 ℃)退火30 s、72 ℃延伸30 s，50 个循环扩增后再72 ℃延伸7 min，PCR 荧光收集设为84 ℃30 s。熔解曲线程序为95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，60 ℃15 s。每次PCR 扩增均设立PDLIM4 质粒为模板的阳性对照和无菌水为模板的空白对照。用30 g/L 琼脂糖凝胶80 V 电泳扩增产物，1 h 后在Gene Genius 凝胶成像仪上显像并拍照。

1.6 PDLIM4 基因甲基化检测

应用Methyl Primer Express v1.0(美国ABI 公司)设计引物(表1)。2 μL 修饰的DNA 作为RQMSP 模板，其余体系同RQ-PCR。PCR 循环反应及熔解曲线的条件同前述，更改退火温度(M 62 ℃、U 58 ℃和ALU62 ℃)。

1.7 PCR 产物克隆测序

将PDLIM4 表达、M、U 以及ABL、ALU阳性的扩增产物经由生工生物(上海)有限公司克隆测序，验证所得序列。

1.8 细胞遗传学检查

运用直接法及24 h 短期培养法，将采集的骨髓细胞制备成染色体标本，进行R 显带后按照《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)》做核型分析。

1.9 分析方法

PDLIM4 标准化的比率按照公式NPDLIM4=(EPDLIM4)△CT÷(EABL)△CT进行计算。扩增效率E =10(-1/slope)(Slope 指标准曲线中CT-cDNA 浓度扩增图的斜率);△CT 指对照标本和被检测标本CT 值之间的差值;对照标本中，PDLIM4 和ABL △CT 最小的1例被选作参照标本，并且认为其表达水平为100%。

PDLIM4 基因启动子甲基化相对定量的计算方法同表达的一致，但需将PDLIM4 表达的CT 值替换成甲基化的CT 值，内参变为ALU;选择对照组中PDLIM4 和ALU △CT 最小的为参照标本，视作启动子100%甲基化。

1.10 统计方法

应用SPSS 17.0 软件做统计学分析。用Mann-Whitney U 检验分析对照组和CML 组以及CML 不同分期间PDLIM4 表达/甲基化相对含量及临床资料的差异;用Pearson＇s χ2检验或者Fisher＇s 确切概率法分析不同组间PDLIM4 低表达/高甲基化频率的差异;采用Spearman 秩相关进行相关性分析。所有分析设定P值为双侧分布，并以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CML 患者中PDLIM4 的表达状况

21例对照中均能检测到PDLIM4 表达，范围0.16 ～1. 00(中位0. 40)。选择低于0. 06(即均数-1.5标准差)作为PDLIM4 基因低表达的阈值。36例CML 患者中PDLIM4 表达水平为0.00 ～5.77(中位0.25)，其中8例(22%)呈低表达，低表达率与对照组的差异有统计学意义(Fisher＇s 确切概率法，P=0.021)。CML 患者中PDLIM4 表达水平和bcr/abl融合基因转录本水平正相关(r= 0.434，P=0.043)，与年龄、性别、血红蛋白量、外周血白细胞计数及血小板计数均无相关性(P＞0.05)，但核型分组间低表达率差异有统计学意义(χ2=8.996，P=0.010)(表2)。3例急变期患者中PDLIM4 均为低表达，而其余33例慢性期患者中仅5例为低表达，差异具有统计学意义(P=0.008)。

2.2 CML 患者PDLIM4 基因启动子甲基化水平

24例对照的甲基化水平为0 ～1.0145(中位0.06)，选择≥1.22(即对照组平均值+3 倍标准差)作为确定PDLIM4 高甲基化阳性。59例CML 中13例(22%)出现PDLIM4 高甲基化，而24例对照未显示高甲基化，两者差异有统计学意义(Fisher＇s 确切概率法，P=0.016)。选择M、U 阳性的扩增产物进行克隆测序，测序结果如图1 所示。

PDLIM4 甲基化状态与CML 患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数及bcr/abl含量均无相关性;核型分组间PDLIM4 高甲基化率也不存在统计学差异(P=0.148)，见表3。

2.3 不同分期CML 患者PDLIM4 甲基化水平的变化

59例CML 患者中，16%(7/44)慢性期、33%(2/6)加速期以及44%(4/9)急变期的患者存在PDLIM4 高甲基化。加速期和急变期患者的PDLIM4甲基化水平高于慢性期患者(P=0.052)。PDLIM4 基因RQ-PCR 和RQ-MSP 的典型电泳结果见图2。

动态监测1例CML 患者，初发时PDLIM4 甲基化水平为21.7，经治疗病情缓解后降至0，其bcr/abl转录本也呈下降趋势(6375.84 降至99.52);另外监测1例初诊后疾病进展患者的标本，发现PDLIM4 甲基化水平由慢性期的3.24 上升到急变期的27.84。

表2 CML 患者PDLIM4 表达量与临床特征的关系Tab 2 Correlations of PDLIM4 expression status with clinical features in CML patients

图1 CML 患者PDLIM4 基因启动子的M 和U 亚硫酸氢盐测序结果Fig 1 The bisulfite-sequencing results of methylation and unmethylation of PDLIM4 gene promoter in patients with CML.

表3 CML 患者PDLIM4 甲基化水平与临床参数的关系Tab 3 Correlations of the hypermethylation of PDLIM4 promoter with clinical parameters in CML patients

图2 CML 患者PDLIM4 基因的RQ-PCR 和RQ-MSP 产物电泳结果Fig 2 Electropheresis results of RQ-PCR and RQ-MSP products of PDLIM4 gene in CML patients

2.4 CML 患者PDLIM4 甲基化与表达的相关性

根据我们现有的mRNA 和DNA 标本，共有13例对照和26例CML 患者同时检测了PDLIM4 表达和甲基化水平。26例CML 中，5例高甲基化患者的PDLIM4 表达水平(中位0.12)低于21例PDLIM4 低甲基化者(中位0. 24)，但差异不具有统计学意义(P=0.283)。然而CML 患者高甲基化组PDLIM4 的表达水平显著低于对照组(中位0.52，P=0.012)。

3 讨论

目前普遍认为t(9;22)易位所导致的bcr/abl融合基因是CML 发生的关键因素，而引起CML 疾病进展的机制尚不清楚。近年来的研究表明bcr/abl诱导转录因子CEBPα 下调所导致的分化阻滞及由基因组监视系统失能，端粒缩短及抑癌基因(如TP53、CDKN2A、DAPK1 等)缺失导致的CML 细胞基因组不稳定，都可能与CML 疾病发展有关［9-11]。

候选抑癌基因PDLIM4 已经被发现在多种肿瘤中因启动子高甲基化而低表达。Boumber 等［3]在PDLIM4 高甲基化失表达的结直肠肿瘤细胞株RKO及KCT116 上调PDLIM4 表达，从而抑制肿瘤细胞生长、克隆形成及诱导细胞凋亡;Vanaja 等［5]则发现PDLIM4 再表达会抑制前列腺癌细胞的体内外生长。这些研究都表明PDLIM4 具有抑癌基因的功能。

目前国内外有关PDLIM4 基因在CML 患者中的研究甚少。我们首次检测了CML 中PDLIM4 的表达，证明22%CML 患者中PDLIM4 表达水平明显降低，PDLIM4 与bcr/abl转录本水平密切相关;且随着CML 疾病进展，PDLIM4 低表达患者比例明显增高。同时，我们对PDLIM4 启动子甲基化态势进行了分析，揭示22%CML 患者中存在着PDLIM4 启动子甲基化，且PDLIM4 高甲基化频率随疾病进展而增高，加速期/急变期与慢性期患者间的差异接近于统计学意义，这与Jelinek 等 的报道一致。但是，本研究在同时具有PDLIM4 表达和甲基化水平结果的26例患者中并未发现两者显著负相关，可能原因有二:①本组实验对象数量少，尤其是存在高甲基化改变的病例数过少，影响了统计分析的可靠性;②PDLIM4表达不仅仅受其启动子甲基化调控，可能还受其他机制调控，如组蛋白去乙酰化等;今后对更多CML 患者病例的研究将有利于明确这一问题。

本研究除了发现PDLIM4 启动子甲基化频率随CML 疾病阶段进展而增高外，我们还对2例CML 患者不同时期的标本进行了动态监测，发现1例初诊时PDLIM4 启动子呈高甲基化状态，经治疗病情缓解后转为低甲基化状态;另1例由慢性期进展到急变期后，甲基化水平提高了近9 倍。我们的初步结果提示监测PDLIM4 甲基化态势可能有助于评价治疗效果及监测疾病发展，今后将对更多病例进行监测以明确其临床意义。Jelinek 等［1]还发现PDLIM4高甲基化的CML 患者生存时间明显缩短、与患者对伊马替尼的治疗反应无关，对这类患者可能需要研发新的治疗药物如Src/Abl 抑制剂。

综上所述，PDLIM4 基因启动子高甲基化及低表达可能与CML 患者疾病进展相关。

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