戊糖乳杆菌素pentocin LPEM818的初步纯化及特性研究*

于雷雷，王超，施波，马妙莲，段慧，张明

(安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥，230036)

细菌素(bacteriocin)是一些细菌产生的抗菌多肽或蛋白［1］，因其能被人类胃肠道分泌的蛋白酶降解，对人体无毒副作用，所以具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值，乳酸乳球菌素nisin在乳制品及罐头制品中已得到了广泛的应用［2］。戊糖乳杆菌 (Lactobacillus pentosus)［3］是公认的食品安全菌，因而对戊糖乳杆菌细菌素戊糖乳杆菌素进行了大量研究，有关戊糖乳杆菌素的报道最早见于1999年有关pentocin TV35b的分离纯化［4］，我国在2004年首次报道了pentocin 31－1的分离纯化［5－9］。已报道的产细菌素戊糖乳杆菌有 L.pentosus TV35b［4］、L.pentosus 31 －1［5－9］、L.pentosus ST151BR［10］、L.pentosus B96［11］、L.pentosus ST712BZ［12］、L.pentosus S-PT84［13］、L.pentosus b240［14］、L.pentosus IG1［15］、L.pentosus［16］、L.pentosus C50-6［3］、L. pentosus 191 和 L. pentosus 204［17］等。

戊糖乳杆菌素多属于II类细菌素，分子量较小、热稳定性高、主要抑制革兰氏阳性菌［4］，但pentocin C50-6还能抑制革兰氏阴性菌［3］，在N-末端具有 IIa类细菌素的保守序列YGNGV，对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19115有较强的抑制作用［5］。L.pentosus B96和L.pentosus IG1所产的IIb类细菌素均由2个高度疏水、对热稳定的小分子肽组成，2个组分在抑菌功能上具有协同作用［11，15］。Pentocin C50-6 由于没有进行序列测定，仅根据分子量和抑菌谱的分析推测其可能属于抑菌谱较广的I类或II类细菌素［3］，暂未发现属于IIc类、IId类、III类和IV类的戊糖乳杆菌素。细菌素的抑菌方式一般分为抑菌、杀菌不溶菌和杀菌且溶菌3种类型，研究表明现已报道的pentocin TV35b和pentocin 31-1对指示菌的的作用方式均为杀菌不溶菌［4－5］。戊糖乳杆菌素由于可耐受高温处理，且大部分在酸性或弱碱性条件下稳定［2－9］，因而在食品领域具有广泛的应用前景。本文主要探讨了戊糖乳杆菌LPEM818细菌素的生物学特性以及对指示菌的作用方式等，以待为该细菌素的应用和进一步研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

产细菌素菌株:戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)LPEM818为安徽农业大学生命科学学院实验室筛选保藏;指示菌株见表2。

1.1.2 培养基

MRS培养基和 LB培养基［18］。

1.1.3 主要药品试剂

胃蛋白酶(BBI)，木瓜蛋白酶(Sangon)，脂肪酶(Sigma)，过氧化氢酶(Sigma)，凝乳蛋白酶(BBI)，胰蛋白酶(BBI)，蛋白酶K(Sigma)，Sephadex G-25(GE Healthcare)，BSA(BBI)，Folin-酚试剂(Sangon)，尿素(BBI)，EDTA(BBI)，SDS(BBI)等。

1.2 实验方法

1.2.1 Pentocin LPEM818的活性及效价的测定

采用牛津杯双层平板法［19］和双层平板二倍稀释法［20］。

1.2.2 蛋白质浓度的测定

Lowry 法［21］。

1.2.3 Pentocin LPEM818 的初步纯化［22］

接种6环菌株LPEM818于MRS培养基中，37℃培养14 h作为种子液。按4%的体积比将种子液接种于4 L MRS培养基中，37℃培养24 h。将发酵液离心，过滤(0.45 μm)，上清液进行80% 硫酸铵沉淀，4℃过夜，离心取沉淀，重悬于 ddH2O中，用透析袋(500 u)透析脱盐，经氯化钡检测不含硫酸铵，收集透析液，测定其效价并冷冻干燥，得到 pentocin LPEM818干粉。将pentocin LPEM818干粉重悬于ddH2O，得到效价为1 060AU/mL的样品，取5 mL上Sephadex G-25(1.6 cm×100 cm)凝胶层析，流速为0.6 mL/min，流动相为ddH2O。收集各峰进行活性检测，确定其活性峰。

1.2.4 Pentocin LPEM818的生物学特性研究

1.2.4.1 pH值和热稳定性实验

样品用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分别调pH值至 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 和 12.0，补加 ddH2O 使样品终体积相等，以ddH2O同比稀释的样品作为对照，每组设3个平行，37℃水浴6 h后，调 pH值至5.0，检测其抑菌活性。

样品分别进行 4、37、60、80、100 和 121℃水浴 15 min或30 min，以未经处理的样品为对照，每组设3个平行，冰浴10 min后检测其抑菌活性。

1.2.4.2 酶和有机溶剂敏感性实验

样品用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分别调至各酶最适pH值，使各酶的最终浓度为5 mg/mL，以ddH2O同比稀释的酶和同比稀释的样品分别作为对照，每组设3个平行，37℃水浴8h，沸水浴10 min，检测抑菌活性。

样品分别加入1%体积比的 SDS、尿素、NaCl、EDTA、Triton X-100、吐温-80和乙腈，以 ddH2O 同比稀释的有机溶剂和同比稀释的样品分别作为对照，每组设3个平行，37℃水浴4h，检测抑菌活性。

1.2.4.3 抑菌谱的测定

采用牛津杯双层平板法，分别对供试G+菌株和G－菌株做抑菌实验。

1.2.4.4 作用方式的测定

将菌株533接种于LB培养基中，37℃培养14 h(OD600=2.89)作为种子液，按4%的体积比接种于LB培养基，分成两组，一组在8h后加入 pentocin LPEM818样品，另一组加等体积的无菌生理盐水作为对照，37℃培养26 h，每2 h取出5 mL，测定OD600，计算菌落数(CFU/mL)，每次测3个平行。

1.2.4.5 生理曲线的测定

将菌株LPEM818的种子液按4%的体积比接种于MRS培养基中，37℃培养。每隔2 h取样，测定OD600，pH值和上清液抑菌活性，各设3个平行。

2 结果与分析

2.1 Pentocin LPEM818的初步纯化

为了对pentocin LPEM818进行初步纯化，本实验以80%硫酸铵沉淀样品为材料，进行了Sephadex G-25(1.6 cm×100 cm)凝胶层析分析(图1)。上样量为5 mL，流速为0.6 mL/min，流动相为 ddH2O，收集各峰并测定活性。

图1 Sephadex G-25层析图谱Fig.1 The chromatogram of G-25

经G-25凝胶层析后，样品有2个峰(图1)，抑菌实验证实第2个峰为活性峰，而第1个峰无抑菌活性，为杂蛋白峰，达到了一定的分离效果。说明硫酸铵沉淀分离法用于初步分离该细菌素是可行的。经过硫酸铵沉淀和G-25层析分离纯化后，该细菌素的纯化倍数为11.09倍，回收率为6.4%(表1)。经Tricine-SDS-PAGE电泳后，出现多条蛋白质条带(结果未显示)，分子质量在6.5～27 ku，说明该细菌素为小分子肽。可能由于样品上样量太少，导致未检测到有抑菌活性的条带;要获取单一条带，有待进一步优化分离纯化条件。

2.2 Pentocin LPEM818的pH值和热稳定性实验

对80%硫酸铵沉淀样品分别在不同的pH值条件下，37℃水浴6 h后，调pH值至5.0，检测抑菌活性，以获得该细菌素的pH稳定性范围。相同样品经不同的温度处理15 min或30 min，冰浴10 min，检测抑菌活性，以获得该细菌素的热稳定性范围。

表1 Pentocin LPEM818的纯化表Table 1 Purification table for pentocin LPEM818

pH稳定性实验结果(图2)表明，样品在pH 4.0～6.0条件下抑菌活性最高，其保留值约为90%，在pH 2.0和8.0条件下抑菌活性仍保留在80%，当pH在10.0或12.0时抑菌活性完全丧失。因此，该细菌素具有较好的酸和弱碱稳定性。热稳定性实验结果(图3)表明，样品经4～80℃处理后，抑菌活性保留在90%以上。经100℃处理30 min和121℃处理15 min后，抑菌活性保留在80%以上，而经121℃处理30 min后，其抑菌活性仍保留在66.98%。因此该细菌素是一种热稳定型的细菌素。

图2 不同pH对样品抑菌活性的影响Fig.2 The antibacterial activity of sampleat the different pH

图3 不同温度对样品抑菌活性的影响Fig.3 The antibacterial activity of sample at the different temperature

2.3 Pentocin LPEM818对酶和有机溶剂的敏感性实验

对80%硫酸铵沉淀样品分别经不同的酶在37℃条件下处理8 h，沸水浴10 min，检测抑菌活性，以确定该细菌素的酶敏感性。相同样品经不同的有机溶剂在37℃条件下处理4 h，检测其抑菌活性，以确定该细菌素的有机溶剂敏感性。

对酶敏感性实验结果(图4)表明，样品经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后抑菌活性完全丧失，所以对其敏感;样品经凝乳蛋白酶处理后抑菌活性下降15%，所以对其较敏感;样品经脂蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶处理后抑菌活性基本不变，所以对其不敏感，因此该细菌素为蛋白类抑菌物质。对有机溶剂敏感性实验结果(图5)表明，样品经尿素处理后抑菌活性下降14%，所以对其较敏感;样品经 Triton X-100、NaCl、吐温-80和乙腈处理后抑菌活性不变，所以对其不敏感;该细菌素与SDS或EDTA共同作用时，抑菌效果明显好于单一作用，因此二者具有协同抑菌作用。

图4 不同酶对样品抑菌活性的影响Fig.4 The antibacterial activity of sample at the different enzymes

图5 不同有机溶剂对样品抑菌活性的影响Fig.5 The antibacterial activity of sample at the different organic solvent

2.4 Pentocin LPEM818抑菌谱的测定

用80%硫酸铵沉淀样品分别对供试的G+菌株和G－菌株做抑菌实验(表2)，测定抑菌圈直径，以确定该细菌素抑菌谱。

表2 Pentocin LPEM818的抑菌谱Table 2 Antibacterial spectrum of pentocin LPEM818

硫酸铵沉淀样品的抑菌谱测定结果(表2)表明，pentocin LPEM818对供试的G－菌株变形杆菌、鸡白痢沙门氏菌、绿脓杆菌和G+菌株单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、四联球菌的抑制作用明显;对粪肠球菌、发酵乳杆菌、保加利亚乳杆菌、短乳杆菌等近源乳酸菌也有较好的抑制作用。

2.5 作用方式的测定

图6 Pentocin LPEM818对S.pullorum533的作用方式Fig.6 The effect of pentocin LPEM818 on the growth of S.pullorum 533

将接种过菌株533的LB培养基置于37℃培养，每隔2 h取样，测定其OD600值，监测菌体浓度的变化，同时测定CFU监测活菌数量，获得菌体的生长情况(图6)，以确定该细菌素对指示菌的作用方式。

对菌株533作用方式的研究(图6)表明，菌体在12 h后进入生长稳定期。实验组菌株533的活菌数在10 h，从1×108降至1×107，随后趋势略有下降。说明细菌素在短时间内杀死了大量指示菌，该细菌素对指示菌的作用方式为杀菌。而对照组活菌数则呈持续上升趋势，10h后保持稳定;实验组菌株533的OD600在10 h后基本保持恒定，说明该细菌素对指示菌无溶菌现象;而对照组OD600一直呈上升趋势，直至16 h后稳定。因此，该细菌素对指示菌的作用方式仅为杀菌。

2.6 生理曲线的测定

将接种过菌株 LPEM818的 MRS培养基置于37℃培养，每隔2 h取样，测定OD600值，pH值和上清液抑菌活性，以测定该菌株的生理曲线。

菌株LPEM818生理曲线的测定结果(图7)表明，菌株LPEM818置于37℃培养，6 h进入对数中期，16 h进入稳定期，此时OD600值最大，22 h进入衰亡期。发酵上清液的pH值从6.24降至4.50，18 h后保持恒定。在对数期中期开始产生细菌素，且在稳定期后期产量达到最大值，此时抑菌活性达到最高，随后保持稳定，整个过程受pH的影响较小。

图7 L.pentosus LPEM818的生理曲线Fig.7 Production of pentocin LPEM818 during growth of L.pentosus LPEM818

3 讨论与结论

3.1 Pentocin LPEM818的初步纯化

细菌素的分离纯化与其特性研究密切相关。细菌素的初步分离方法有盐析法、有机溶剂沉淀法和pH吸附法等，进一步纯化方法有凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水相互作用层析和反相高效液相色谱等。本研究采用硫酸铵沉淀和Sephadex G-25凝胶层析对pentocin LPEM818进行了初步纯化，最终纯化倍数为11.09倍，但回收率仅为6.4%，说明纯化过程中目的蛋白损失较大。今后应继续对pentocin LPEM818的分离纯化条件进行优化，为将来的精细纯化及应用奠定基础，但是根据其目的蛋白峰，确定了硫酸铵沉淀法样品用于生物学特性研究的可行性。

3.2 Pentocin LPEM818的作用方式

细菌素通常对敏感菌株的作用方式表现为3种类型:抑菌、杀菌不溶菌和杀菌且溶菌。本研究在S.pullorum 533的菌悬液中加入80%硫酸铵沉淀样品后，在短时间内对S.pullorum 533的活菌数产生了有效的抑制作用，并且在加入该细菌素后OD600无明显变化，因此该细菌素对S.pullorum 533的作用方式仅为杀菌。具有与本实验结果相同作用方式的细菌素有 bacTN635［23］和 plantaricin MG［24］，其中 bacTN635的指示菌活菌数下降了6个单位，而OD600无明显变化;plantaricin MG的指示菌活菌数下降了96.3%，而OD600也无明显变化。而 plantaricin TF711［25］的指示菌活菌数在3h内下降了1.3个单位，随后有所上升，9h后保持稳定，其作用方式为抑菌。所以pentocin LPEM818比bacTN635或plantaricin MG的抑菌效果稍差，但优于plantaricin TF711。

3.3 Pentocin LPEM818的生物学特性

细菌素的生物学特性决定其潜在的应用价值。Pentocin LPEM818在pH 2.0～8.0条件下稳定，具有酸和弱碱稳定性的特点，与enterocin LR/6在pH 2.0－8.0条件下抑菌活性保留80%［26］基本相同，但其热稳定性不及pentocin LPEM818。Pentocin LPEM818在121℃处理30 min仍保留67%的抑菌活性，具有较好的热稳定性。具有相似特性的pentocin 31－1在100℃处理 15 min只保留 50%的抑菌活性［7］。pentocin LPEM818热稳定性明显优于pentocin 31－1。pentocin LPEM818对酶的敏感性的特点与Pediococcus pentosaceus CFR SIII所产的细菌素相似，仅对胰蛋白酶和蛋白酶K敏感［27］，但其pH稳定性范围为3.0～5.0明显差于本细菌素。对吐温-80、NaCl、乙腈和 Triton X-100不敏感，对尿素敏感的特点与sakacin LSJ618［28］相一致，进一步表明了该细菌素具有蛋白属性。EDTA或 SDS本身对S.pullorum 533具有抑制作用，pentocin LPEM818与SDS或EDTA共同作用时，抑菌效果明显好于单一作用，因此二者有协同抑菌作用［28－30］。在实验条件下，菌株 LPEM818在对数中期开始产生细菌素，在稳定期后期产量达到最大值，随后保持稳定，产细菌素过程受环境pH的影响较小。该细菌素对供试的大部分G+菌株和G－菌株均具有较强抑制作用，其抑菌谱广，对多数致病菌和食品腐败菌抑菌作用明显，特别是对Listeria monocytogenes ATCC19115和G－菌株较强的抑制作用，所以其具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值。

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