湛江地区养殖南美白对虾冷藏期间的菌相分析及优势腐败菌的初步鉴定*

田凤，王玲

(广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江，524088)

南美白对虾(Penaeus vannamei)学名凡纳滨对虾，是世界上三大产量最高、品质优良的对虾养殖品种之一。它营养丰富、汁鲜肉嫩，且蛋白质含量高达20%，还含有丰富的微量元素和维生素A等成分，深受国内外消费者的喜爱［1］。由于对虾含有大量的水分和丰富的蛋白质，捕获后虾肉中的营养物质如糖、脂、氨基酸等易被微生物分解产生有机酸、胺类以及硫化物等，形成不良的恶臭味甚至有毒物质，从而腐败变质失去食用价值，这些微生物被称为特定腐败菌(SSO)或优势腐败菌［2］。在对虾的冷藏过程中，优势腐败菌的生长速度比较快，并且会对营养物质的分解起决定作用。造成对虾腐败的微生物既与自身品种有关，还与它生长的水体环境有关，湛江作为全国最大的对虾养殖基地，有关该地区养殖的南美白对虾低温冷藏保鲜时的菌相变化和优势腐败菌的分离鉴定的相关资料至今还未见报道。

本研究通过对湛江地区养殖的南美白对虾冷藏过程中的菌相分析及优势腐败菌的分离和初步鉴定，为该地区养殖南美白对虾冷藏冷冻保鲜产品货架期的预测和靶向抑菌的保鲜方法提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 原料

鲜活南美白对虾:采购于湛江东海养殖场。

对虾采样后尽快加氧保活运送至实验室，挑取完整鲜活的个体，加冰猝死，去头后流水冲洗，然后晾干并随机分为7组，分别用保鲜袋包装后于(4±1)℃条件下保藏。

1.2 试剂

NaOH、NaCl、HCl、计数琼脂、营养琼脂、革兰氏染色试剂盒(北京陆桥)、1%盐酸二甲基对苯二胺、1%a-萘酚-乙醇溶液、氧化发酵 O/F培养基、氧化三甲胺培养基(上海源叶)、美蓝溶液、3%H2O2液等。

1.3 仪器和设备

双面垂直超净工作台SW-CJ-2(上海绿宇);电热鼓风干燥箱BGZ-146(上海绿宇);高压蒸汽灭菌锅YXQ-SG46-280S(上海博讯);电热恒温培养箱HPX-9162MBE(上海博讯);电热恒温水浴锅 HH.S11-2(上海博讯);生物显微镜XSP-2CA(上海光学仪器)。

1.4 分析和检验方法

感官评分:参照曹荣“对虾生物保鲜与其熟制品保藏技术的研究”中对虾感官评定标准进行［3］。

细菌总数测定(CFU/g):采用GB/T 4789.2－2010食品卫生微生物学检验菌落总数测定的方法［4］。

平板划线分离:参考张娴等“活性污泥中细菌的分离、纯化与培养”中平板划线的方法进行［5］。

生理生化鉴定:按照Bagge-Ravn等提出的海产鱼贝类细菌测定图示［6］和《常见细菌系统鉴定手册》［7］以及《伯杰细菌鉴定手册》［8］进行。

1.5 实验操作要点

1.5.1 南美白对虾冷藏过程中的细菌总数测定

采用平板菌落计数法测定南美白对虾冷藏过程中的细菌总数。对虾经去头清洗后分组，在(4±1)℃条件下冷藏，然后每天从冰箱中取出对虾样品一组，按照曹荣［3］的方法进行感官鉴定。取同组中的南美白对虾适量，去壳，虾肉匀浆后制成含菌样液，然后按照黄秀梨等［9］主编的微生物学实验指导进行10倍梯度稀释。取适当稀释倍数的样液1 mL，与10 mL的计数琼脂培养基混合，培养基需预先冷却至50℃左右，使它既不凝固，又不会烫死样液中的微生物。待混合有样液的培养基凝固后于30℃倒置培养72 h，参照文献［4］的方法计算细菌总数。

1.5.2 细菌的分离与鉴定

将菌落数为30～100个的计数平板上的细菌进行纯化分离，之后将这些细菌按个体形态、菌落特征和革兰氏染色结果进行分组，参照海产鱼贝类细菌测定图示［6］以及文献［7－8］中关于细菌鉴定的方法，将每一组中的细菌进行相关的生理生化实验，如氧化酶实验、O/F发酵实验、氧化三甲胺分解实验、H2O2酶实验等，初步鉴定到细菌的属。

2 结果与分析

2.1 对虾冷藏过程中细菌总数变化

将湛江地区养殖的南美白对虾经预处理后在(4±1)℃条件下进行冷藏保鲜，每天取样检测其感官品质和细菌总数，结果见图1。

由图1可知，湛江地区养殖的南美白对虾的初始含菌量为2.8×104CFU/g，(4±1)℃条件下冷藏1d后，细菌总数减少为3.4×103CFU/g，这是因为南美白对虾在温暖的水体环境中感染的某些嗜温菌在冷藏时生长受到抑制，只有耐低温的细菌才能大量繁殖;冷藏至第2天，细菌总数为5.1×104CFU/g，此时虾肉品质较好，处于 GB 2733－2005［10］规定的一级鲜度;第3天时，细菌数量增长至4.5×105CFU/g，接近海虾二级鲜度的上限;冷藏至4 d，细菌总数为3.0×106CFU/g，超过106CFU/g，到达货架期终点;冷藏5 d以后，细菌总数的增长变得比较缓慢，可能是由于营养物质大量消耗和腐败菌大量繁殖，抑制了其他微生物生长的缘故。冷藏至第6天，细菌总数高达2.4×107CFU/g，虾肉完全腐败变质，不能食用。

图1 对虾冷藏过程中细菌总数和感官评分变化Fig.1 Changes in bacterial amount and sensory score of Penaeus vanmamei during refrigerated storage

感官评定的结果与细菌总数的变化基本一致，第4天的感官评分为9分，参照文献［3］，此时感官上已不可接受，货架期结束;第6天的感官评分仅为4分，对虾肌肉已腐败，气味和色泽也不可接受。本实验条件下冷藏南美白对虾的货架期为4 d，这与曹荣等［11］的研究结果一致，而郭红等［12］的研究表明，初始细菌总数不同，导致用更低的温度保藏时其货架期也为4 d，说明初始含菌量是影响货架期的最主要的因素。

2.2 细菌的分组与鉴定

湛江地区养殖的南美白对虾在(4±1)℃条件下冷藏时分离得到的细菌按形态特征、革兰氏染色后可分为10组，将每组中的细菌进行生理生化鉴定，其结果见表1。

由表1可以看出，10组细菌形成的菌落大都是白色、圆形、粘稠、隆起、表面光滑、边缘整齐且不透明的，但第Ⅴ组为黄色、第Ⅵ和第Ⅸ组为浅黄色菌落，Ⅶ、Ⅹ组菌落扁平、形状不太规则且边缘不完整，Ⅰ、Ⅵ组菌落半透明，Ⅰ、Ⅲ、Ⅶ组菌落表面干燥且Ⅰ、Ⅵ、Ⅸ组产生难闻的臭味;通过革兰氏染色和镜检可知，第Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ组为 G－，Ⅱ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ组为G+，Ⅳ和Ⅷ组是球菌，其他为杆菌。由表1的菌落特征和生理生化实验结果结合Bagge-Ravn等提出的海产鱼贝类细菌测定图示［6］可以初步判定，第Ⅰ组为假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、第Ⅱ组为乳酸菌属(Lactic acid bacteria spp.)、第Ⅲ组为肠杆菌属(Enterobacteriaceae spp.)、第Ⅳ组为葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、第Ⅴ组为黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、第Ⅵ组为希瓦氏菌属(Shewanella spp.)、第Ⅶ组为棒杆菌属(Corynebacterium spp.)、第Ⅷ组为微球菌属(Micrococcus spp.)、第Ⅸ组为气单胞菌属(Aeromonas spp.)、第Ⅹ组为不动杆菌属(Acinetobacter spp.)。

表1 细菌的形态特征及生理生化特性Table 1 The morphological characteristics and physiological-biochemical characteristic of bacteria

2.3 南美白对虾冷藏过程中的菌相变化

将南美白对虾经去头等预处理后在(4±1)℃条件下冷藏，分别对冷藏初期(第0天)、高品质期(第2天)和货架期终点(第4天)的细菌进行分离和鉴定。由细菌的形态特征结合生理生化实验分析得到南美白对虾冷藏过程中的菌相变化，其结果如表2所示。

表2 南美白对虾冷藏过程中的菌相变化Table 2 Bacterial flora change in Penaeus vanmamei during refrigerated storage

由表2可见，在南美白对虾的冷藏过程中革兰氏阴性菌占有绝对优势，冷藏初期分离获得的10个属的细菌中，有6个属为G－，其数量占细菌总数的80%，且以黄杆菌的数量最多，占细菌总数的33.3%，其次是气单胞菌，百分含量为13.3%，不动杆菌和假单胞菌占有10%的相同比例;冷藏至第2天，此时的对虾为高品质期，G－的数量增长至86.7%，仍以黄杆菌(30%)的数量最多，不动杆菌由10%增长到16.7%，气单胞菌和假单胞菌均占细菌总数的13.3%;随着冷藏时间的延长，细菌种类逐渐减少，货架期终点只分离到8个属的细菌，其中G－占93.4%，气单胞菌和假单胞菌均增加到16.7%，而黄杆菌减少为26.7%，其他种类的G－均有不同程度的增长。货架期内希瓦氏菌的数量增长缓慢，仅由6.7%增加到10.0%，不动杆菌和肠杆菌的数量较稳定，均占细菌总数的10.0%左右，这与曹荣［11］及赵海鹏［13］等的研究结果存在差异，可能是养殖环境不同导致的初始细菌组成不同所致。

2.4 南美白对虾优势腐败菌的初步鉴定

当南美白对虾冷藏至第6天时，虾肉腐败变质不可食用，在此状态下我们共分离得到87株细菌，按细菌形态特征结合文献［6］进行分类鉴定后发现优势菌有4个属，其各自所占的比例见表3。

表3 南美白对虾冷藏时优势腐败菌的组成Table 3 The composition of dominated spoilage organisms in Penaeus vannammei

从表3可知，4个属的优势腐败菌均为革兰氏阴性菌，它们占细菌总数的93.11%，分别是黄杆菌(28.74%)、气单胞菌(16.09%)、假单胞菌(21.84%)和希瓦氏菌(26.44%)。南美白对虾冷藏时腐败变质主要是由这4个属细菌的分解代谢造成的，黄杆菌对蛋白质有很强的水解能力，它使虾肉在短时间内失去食用价值。气单胞菌与其他腐败菌协同作用，也能水解蛋白质、淀粉和脂肪等，并且产生的尸胺是腐败时不良气味的直接来源［14］。同时，气单胞菌和希瓦氏菌能分解氧化三甲胺(TMAO)生成三甲胺(TMA)，使对虾逐渐失去鲜味而变为难闻的臭鱼腥味。假单胞菌和希瓦氏菌的代谢作用能使虾肉发粘、变色，并产生氨和H2S等而散发出刺鼻的臭味［15］，使虾肉在感官上难以接受。从腐败的南美白对虾虾肉中分离获得的优势菌中，假单胞菌和希瓦氏菌所占比例较高，这与Gill等［16］的研究结果相似，认为假单胞菌和希瓦氏菌的存在是冷链流通中高蛋白水产品腐败的主要原因。

3 结论与讨论

3.1 结论

(1)湛江地区养殖的南美白对虾在4±1℃的冷藏过程中，G－的数量由80.0%增长到93.4%，冷藏初期以黄杆菌和气单胞菌数量最多，其次是不动杆菌和假单胞菌;高品质期黄杆菌和不动杆菌占优势，其次是气单胞菌和假单胞菌;货架期结束时，黄杆菌、气单胞菌和假单胞菌所占比例较大。

(2)南美白对虾在(4±1)℃条件下冷藏至第6天，细菌总数高达2.4×107CFU/g，感官评分仅为4分，虾肉完全腐败变质，不能食用。此时从虾肉中分离得到4个属的优势腐败菌，它们均为革兰氏阴性菌，分别是黄杆菌、希瓦氏菌、假单胞菌和气单胞菌，共占细菌总数的93.11%，它们是导致南美白对虾冷藏时腐败的根本原因。

3.2 讨论

本研究分析的对虾的细菌菌相反映了湛江东海养殖环境下的南美白对虾的细菌组成，当然，细菌的种类和数量还受到季节、捕捞方式等因素的影响［17］。目前，关于鱼、虾的菌相分析的研究并不少见［18］，但是有关湛江地区的养殖虾的细菌组成的研究还甚少。虽然不同地区的南美白对虾初始含菌量相差并不明显，但是其细菌组成却有较大的差异，导致保藏过程中呈优势生长并对腐败起主要作用的细菌的组成也有所不同。

以食品保藏为目的的细菌鉴定到属就已经足够了，目前，关于细菌鉴定的方法有多种，并且日益精确、方便和快捷，传统的通过细胞形态和习性的观察只能对细菌进行初步鉴定。随着分子生物学的发展，以肽聚糖为基础的细胞化学成分的分析、以蛋白质为基础的蛋白质水平的鉴定和以核酸为基础的核酸水平的鉴定都使细菌分类更加快速、准确。目前，国内外关于特定腐败菌的研究已比较深入，多数学者认为耐冷的假单胞菌和希瓦氏菌是对虾冷藏过程中的特定腐败菌，本研究发现，湛江的养殖环境使南美白对虾的优势腐败菌变为黄杆菌和希瓦氏菌，其次是假单胞菌和气单胞菌，它们占了细菌总数的90%以上，是腐败的直接原因。

对对虾冷藏时的细菌菌相和优势腐败菌进行分析，可以为靶向抑菌的保鲜方法的开发提供数据支持，还可以为优势腐败菌生长动力学模型的构建和产品鲜度以及货架期的预测提供理论依据。

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