桂花中总黄酮提取工艺及采收期研究*
2013-05-05陶阿丽戴一华芳
陶阿丽，戴一，华芳
(安徽新华学院 药学院，安徽合肥，230088)
桂花(Osmanthus fragrans Lour)又名木犀，为常绿乔木或灌木。桂花是珍贵的观赏性芳香植物，也是我国主要芳香原料之一，分布较广。中医认为，桂花性温味辛，煎汤、泡茶或浸酒内服，可以化痰散瘀，对食欲不振、痰饮咳喘、肠风血痢、闭经腹痛有一定疗效。研究表明，桂花含有丰富的脂肪、蛋白质、碳水化合物及多种氨基酸、维生素等成分，其中蕴含的总黄酮类物质具有减少和消除自由基、抗氧化、抗血栓、抗癌、抗炎、降血脂、预防心脏病、抑菌、免疫调节等作用［1－3］。近年来由于自由基生命科学的进展，使具有很强抗氧化性和消除自由基作用的黄酮类物质受到重视［4－5］。本实验将具体研究桂花中总黄酮的适宜提取工艺，及不同开放形态下桂花中总黄酮的含量。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
桂花(采自安徽新华学院校园，经庆兆老师鉴定为金桂，于2012年9月13日桂花开苞开始采摘，3 d采摘1次，至花谢共采摘4次，采摘后置于干燥箱中恒温36℃烘干保存)、芦丁对照品(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，1198－101018)、硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇等均为分析纯。
DZF-6020型真空干燥箱(上海三发科学仪器有限公司);UV-4802S型紫外可见分光光度仪(尤尼柯(上海)仪器有限公司;FA2004型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 供试品溶液的制备［6］
精密称取1.0 g干燥的桂花，置于圆底烧瓶中，恒温浸提后，将乙醇浸提液用过滤，用蒸馏水定容至100 mL即得。
1.2.2 检测波长的选择
精密量取0.192 mg/mL芦丁标准溶液1.50 mL，至于10 mL容量瓶中，加入体积分数70%的乙醇于5 mL，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，放置6 min;再加入10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，放置6 min;加入1.0 mol/L NaOH溶液4.0 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以不加芦丁对照品的溶液为空白，选择于在外分光光度在450～600 nm波长内扫描。
1.2.3 对照品溶液制备与标准曲线的绘制［7］
精密称取芦丁标准品10 mg，置于小烧杯中，用体积分数70%乙醇溶解并转移至50 mL容量瓶中定容，摇匀，既得0.200 mg/mL的芦丁标准溶液。精密量取芦丁对照品溶液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加入体积分数为70%的乙醇至10 mL，加入5%亚硝酸钠1.00 mL，摇匀，放置6 min;再加入10%Al(NO3)3溶液1.00 mL，摇匀，放置6 min;加入1.0mol/L NaOH溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以不加芦丁对照品溶液为空白，在510nm处测吸光度，以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.4 正交试验设计
本实验选定乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取次数(C)、提取时间(D)4个因素，采用L9(34)正交安排表实验，因素与水平见表1，实验安排见表2。
1.2.5 采收期的选择
取不同采收期桂花按优化工艺进行提取后制备供试品溶液备测。
表1 因素与水平Table 1 Factors and levels
1.2.6 样品分析
对正交试验及采收期供试品溶液按1.2.3项下方法进行显色，紫外分光光度计测定吸光度，计算样品中总黄酮含量。
2 结果与分析
2.1 检测波长的确定
芦丁溶液检测波长研究的扫描结果见图1。在波长450～510 nm之间吸光度不断增大，当波长超过510 nm之后，吸光度呈下降趋势，因此确定测定波长为510 nm。
图1 检测波长扫描图Fig.1 The scanning figure of detecting wavelength
2.2 标准曲线的绘制
通过测定不同浓度的芦丁对照品溶液吸光度，以浓度(c，mg/mL)对吸光度A进行回归分析，得回归方程为:A=0.100 8c+0.030 5(R2=0.993)，芦丁在0.008～0.048 mg/mL浓度范围内线性关系良好。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度实验结果
准确吸取芦丁对照品溶液2.00 mL于10 mL容量瓶中，加一定量 70%乙醇至 5 mL，加入 5%Na2NO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min;再加入10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，摇匀，放置 6 min;加入 1 mol/L NaOH溶液4 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以不加芦丁对照品为空白，在510 nm处测定吸光度，连续 6次，平均吸光度为 0.406，RSD为1.02%，精密度良好。
2.3.2 稳定性试验结果
精密吸取1份供试品溶液2 mL，按照1.2.3项下方法显色，分别于间隔 0、10、20、30、40、50、60 min，在510 nm波长处测定吸光度，1 h内吸光度值无明显变化，RSD 1.28%，供试品溶液显色后在1 h内稳定。
2.3.3 重复性试验结果
按照供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液(药材重量相同)，分别按照1.2.3项下方法显色测定，计算多总黄酮含量，RSD 1.56%，此方法重复性良好。
2.4 正交试验结果
正交试验结果及分析见表2。
表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test
由表2数据可以看出，浸提次数对桂花总黄酮的提取效果影响最大，其次是乙醇浓度，在这4个因素中，影响最小的是浸提时间，由此可知，各因素对提取效果影响顺序为:浸提次数(C)＞乙醇浓度(A)＞液料比(B)＞浸提时间(D)。实验最佳条件为A3B3C3D2，即:乙醇浓度60%，每次液料比1∶30，浸提次数3次，浸提时间90 min。
2.5 验证试验结果
为了考察所选择最佳工艺的稳定性，对其进行验证。称取桂花100 g，3份，按照优选的工艺条件，即乙醇浓度60%，每次液料比1∶30，浸提次数3次，浸提时间90 min，依法测定其桂花总黄酮的含量，结果见表3。
表3 验证试验结果Table 3 Results of verification test
由表3可以看出，该提取工艺稳定、可靠，达到提取优化的目的
2.6 不同时期采收的桂花对总黄酮提取的影响
在最佳实验条件下，对不同采收期的桂花进行提取，按1.2.1制备供试品溶液，再按1.2.3显色，测定吸光度，结果如表对实验进行编号，9月13日为A组，9月16日为B组，9月19日为C组，9月22日为D组，实验结果如表4。
表4 不同采收期桂花中总黄酮的含量测定Table 4 Total flavonoids from Sweet-scented osmanthus in different harvest times
由表4可知，桂花花期中，总黄酮含量前期呈上升趋势，盛开时总黄酮含量最大，凋谢时含量最少。
3 结论
桂花既可以作为观赏植物，又具有一定的药用价值，另外在食品开发方面具有重要的应用，以桂花开发的食品众多，且具有一定的保健价值。黄酮成分是桂花所含的一类重要的成分，具有多种药理作用，如抗衰老［3］、抗癌等。研究桂花中的黄酮成分对于桂花保健食品的开发具有重要的价值。本实验不但优化了桂花中黄酮成分的浸提工艺，也考察了桂花中黄酮随着生长期的动态变化规律。对于桂花中黄酮成分的开发具有重要价值。
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［6］ 蔡健，王薇，陈国威，等.桂花黄酮类化合物最佳提取工艺研究［J］.粮油食品科技，2005，13(1):16－18.
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