黑羽乌骨鸡毛中黑色素提取工艺

徐顶巧，周建军

(陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中，723000)

乌骨鸡(Gallus gellus demesticus Brissen)又名乌鸡，属于鸟纲、鸡形目、雉科、鸡属。乌骨鸡的药用价值和食用价值存在于体内黑色素物质，其具有抗诱变、提高机体免疫力、延缓衰老、抑制病毒、消除自由基、抗氧化等功能［1－5］，乌骨鸡黑色素已被证实是真黑色素［6］。

黑色素是一种不溶于水和几乎所有溶剂的生物多聚体［7］，黑色素的提取方法有蛋白酶解法、盐酸水解法等。蛋白酶解法提取时对黑色素在形态学和化学结构上损伤的程度小于盐酸法，且清除自由基的效果略优于盐酸法，但其成本较高且在光稳定性方面要低;盐酸水解法对黑色素的形态和化学结构有一定损伤，但其光稳定性较好，操作简单易行［8］。

以乌骨鸡肉、内脏作为原材料提取黑色素的方法已有文献报道，但其原材料成本较高，难以应用，仅停留在实验室阶段。本实验以废弃的黑羽乌骨鸡毛为原料，利用盐酸水解法从乌骨鸡毛中提取黑色素，在单因素实验基础上通过响应面实验分析法对乌骨鸡毛中黑色素提取工艺进行了优化。

1 材料、仪器与试剂

Waters e2695－2489高效液相色谱仪，配有2489紫外检测器和Empower色谱工作站，自动进样，美国Waters公司;AB204－S电子天平，瑞士Mettler Toledo公司;KQ5200DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;D-37520 Osterde离心机，德国 Kendro制造;MH-1000电热套，北京科伟永兴仪器有限公司;302型电热鼓风干燥箱，山东潍坊医药集团股份有限公司医疗器械厂;SHB-III循环式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

浓HCl，北京化工厂，分析纯;NaOH，西陇化工股份有限公司，分析纯;石油醚，天津市富宇精细化工有限公司，分析纯;甲酸、30%H2O2、K2CO3、Na2SO3，天津市天力化学试剂有限公司，分析纯;甲醇 天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯;5-羟基吲哚-2-羧酸，Sigma公司。

黑羽乌骨鸡鸡毛，取自汉中市黑凤园乌鸡养殖基地，平均日龄150 d。乌骨鸡毛经洗涤晾晒，于65℃烘干备用。

2 实验方法

2.1 乌骨鸡毛黑色素的检测方法

2.1.1 色谱条件

参考Ito的方法［9］，并经试验色谱条件确定为:色谱柱 ODS-3 C18柱 (150 mm ×4.6 mm，4 μm)，检测波长:270 nm，流速1.0 ml/min，柱温25℃，进样量10 μL，流动相 V(1% 甲酸)∶V(甲醇)=60∶40，保留时间:30 min。

2.1.2 对照品溶液的制备

2，3，5-三羧基吡咯(PTCA)的制备参考 Ito的方法［9］:精密称取 5-羟基吲哚-2-羧酸 50 mg，溶于 50 mL 1.0 mol/L K2CO3溶液中，加入体积分数30%H2O22 mL，置100℃加热20 min。流水冷却，加入质量分数10%Na2SO33.0 mL终止反应，用6.0 mol/L HCl调节pH值至1左右，冷却，用50 mL乙醚萃取5次，合并乙醚萃取液，萃取液浓缩到一定体积，挥干乙醚真空干燥。精密称取10 mg沉淀，用质量分数0.1%甲酸定容至25 mL，摇匀，作为对照品储备液(PTCA 浓度为400 μg/mL)。

精密吸取对照品储备液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于5个10 mL的容量瓶中，用0.1%甲酸溶液定容，混匀，即配成浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的5个不同浓度的对照品溶液。

2.1.3 标准曲线的建立

将5个不同浓度的PTCA对照品溶液依次分别进样10 μL，记录峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，以浓度(X)为横坐标，用直线回归方程的方法建立标准曲线，PTCA的直线方程为:Y=9.96×103X－4.99×104(r=0.999 203)，其浓度在20.00 ～100.00 μg/mL内，线性关系良好。

2.1.4 供试品的氧化处理及测定

分别精密称取(单因素实验)提取时间3、6 h所得黑色素粗品和响应面模型验证性实验所得黑色素粗品各10 mg，加入1.0 mol/L K2CO38.6 mL和体积分数3%H2O20.8 mL，置100℃水浴20 min，流水冷却后，加入10%Na2SO30.4 mL终止反应，用6.0 mol/L HCl调节pH值至1左右，过滤后取上清液，用50 mL乙醚萃取5次，合并乙醚萃取液，萃取液浓缩到一定体积，挥干乙醚抽真空干燥后，用流动相复溶，定容至25 mL，用0.45 μm有机膜过滤，与标准曲线相同的色谱条件下进样，重复进样3次，取平均值，根据标准曲线计算出PTCA的含量，通过黑色素对照样品与PTCA含量间的换算系数，得出供试品中黑色素的含量。

2.1.5 乌骨鸡毛中黑色素含量与PTCA含量换算系数的确定

称取盐酸水解黑色素300 mg置于水解装置中，加入10 mol/L HCl 120 mL，密封置于120℃烘箱内完全水解12 h。挥干盐酸后，蒸馏水洗净，沉淀黑色素低温干燥，作为乌骨鸡毛黑色素样品。分别精密称取乌骨鸡毛黑色素对照样品10 mg，参考2.1.2对照品溶液的制备方法进行氧化处理，得到对照样品溶液，按3.1.1同样色谱条件进样，测得对照样品PTCA含量，建立样品黑色素与PTCA含量间的换算关系。乌骨鸡毛黑色素样品的对照品氧化后PTCA含量见表1。乌骨鸡毛黑色素氧化后PTCA平均得率为16.18%，RSD为0.344% 。因此乌骨鸡毛黑色素与PTCA间的关系即:黑色素=6.21×PTCA(mg)。

表1 黑色素对照品氧化后PTCA含量Table 1 PTCA yield of the oxygenated standard substance of melanin

2.2 乌骨鸡毛黑色素的提取

采用HCl水解法提取，选择HCl浓度、料液比和提取时间进行单因素实验，在此基础上进行响应面实验，并以黑色素得率(黑色素得率/%=黑色素质量/原材料质量×100)为指标，确定最佳的提取条件，并对最佳提取条件进行验证性实验。

2.2.1 单因素实验

2.2.1.1 盐酸浓度对黑色素得率的影响

称取30 g乌骨鸡毛，置1 000 mL圆底烧瓶，分别加入10%、15%、20%、25%、30%HCl溶液 150 mL，用带有吸收氯化氢的热回流装置，在110～112℃条件下，热回流提取5 h，冷却至室温后通过涤纶纱布粗滤。将滤液在3 800 r/min条件下离心10 min，弃上清液。沉淀经过多次水洗直到pH为中性，在65℃条件下烘干，即得黑色素粗品。将粗品以1∶10(g∶mL)加入石油醚，超声2次，每次0.5 h，抽滤，真空干燥得到黑色素样品，称重以考察盐酸浓度对黑色素得率的影响。

2.2.1.2 料液比对黑色素得率的影响

称取30 g乌骨鸡毛，置1 000 mL圆底烧瓶，分别按 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 加入 25%HCl提取，其他条件固定不变，以考察料液比对黑色素得率的影响。

2.2.1.3 提取时间对黑色素得率的影响

称取30 g乌骨鸡毛，置1 000 mL圆底烧瓶，其它条件固定不变，分别提取2、3、4、5、6 h，以考察提取时间对黑色素得率的影响。

2.2.2 响应面实验设计

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken设计原理，选取料液比 X1(1∶1～1∶3)、HCl浓度 X2(20% ～30%)、提取时间X3(5～7 h)3个对乌骨鸡毛黑色素得率影响显著的因素，以黑色素得率为响应值，采用3因素3水平的响应面分析法，设计方案见表2。

表2 响应面分析因素与水平Table 2 Variables and levels in response surface design

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果与分析

3.1.1 盐酸浓度对黑色素得率的影响

HCl浓度对黑色素得率的影响结果见图1所示。

图1 HCl浓度对黑色素得率的影响Fig.1 Effect of the concentration of hydrochloric acid on melanin yield

由图1可知，随着HCl浓度的升高，黑色素得率呈明显递增趋势，当HCl浓度达到30%后，黑色素得率最高，在反应过程中，由于HCl在沸腾状态极强的挥发性，再提高HCl浓度黑色素得率也不明显递增，故HCl浓度以25%为宜。

3.1.2 提取时间对黑色素得率的影响

提取时间对黑色素得率的影响结果见图2所示。

图2 提取时间对黑色素得率的影响Fig.2 Effect of the extraction time on melanin yield

由图2可知，3 h内随着提取时间的延长，黑色素的得率呈明显递增趋势，当提取时间达到3 h后，黑色素得率随提取时间延长而降低，到5 h后，随着提取时间延长黑色素得率稍有回升，6 h后随着提取时间延长黑色素得率趋于稳定。上述曲线表明，3 h之前可能是水解过程中未完全除去与黑色素结合的蛋白质及脂类物质，因此黑色素得率增高;3 h后，随着与黑色素结合的蛋白质水解，黑色素得率逐步降低，6～7 h黑色素得率逐步稳定。为了证实上述推测对3、6 h提取的黑色素进行了含量测定，结果见表3。

表3 水解3 h及6 h样品中PTCA得率及黑色素含量Table 3 The yield of PTCA and the content of melanin in the sample of hydrolysis in 3 h and 6h

由表3可知，水解3h黑色素样品PTCA得率为4.31%，黑色素含量仅为26.77%;而水解6h黑色素样品PTCA得率为12.18%，黑色素含量为75.63%，无论是PTCA得率，还是黑色素的含量都明显高于水解3h的含量，因此水解时间选为6 h。

3.1.3 料液比对黑色素得率的影响

料液比对黑色素得率的影响结果见图3所示。

图3 料液比对黑色素得率的影响Fig.3 Effect of the material liquid ratio on melanin yield

由图3可知，随着料液比的增大，黑色素得率呈明显递增趋势，当料液比达到1∶2后，黑色素得率趋于平缓，故料液比以1∶2为宜。

3.2 响应面结果及分析

响应面分析方案及实验结果见表4。表4中1～12是析因试验，13～17是中心试验。17个试验为析因点和零点，其中分析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点;零点为区域的中心点，零点实验重复5次，用以估计误差。

表4 响应面分析方案及实验结果Table 4 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

由表5中回归模型的方差分析可知，上述回归方程中因变量与各自变量之间线性关系显著(r=模型平方和/总离差平方和=0.995 2)，该模型高度显著(P＜0.000 1)，说明此实验方法可靠。同时由于回归方程的失拟误差不显著(P=0.642 1)，因此该回归方程可用于实验结果的分析和预测。各因素的方差分析表明，X1、X2、X3、X1X2、X2X3、对黑色素得率的影响显著，由此可知各因素对黑色素得率的影响不是线性关系。由分析结果可知，HCl浓度、提取时间和料液比对黑色素得率的影响都达到了高度显著的水平，其中料液比对黑色素得率的影响最显著。

RSM图形是响应值Y对应各因素X1、X2、X3构成的三维空间图及三维空间图在二维平面上的等高线图，本实验的RSM图见4～图6。各个因素交互作用对响应值的影响可以直观的反映出来，其中等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则与之相反。

表5 回归模型方差分析Table 5 ANONA(analysis of variance)of terms of regression equation

图4 料液比和HCl浓度对黑色素得率的影响Fig.4 response surface plot showing the effects of water/material ratio and the concentration of hydrochloric acid on extraction yield of melanin

通过对RSM图进行比较可知，3个因素对响应值影响的显著性表现为曲线的陡度排列为X1(料液比)﹥X2(盐酸浓度)﹥X3(提取时间)，即3个因素对黑色素得率影响显著性大小为料液比﹥HCl浓度﹥提取时间，该结论与回归方程方差分析的分析结果相吻合。

回归模型预测的乌骨鸡毛黑色素提取的最佳工艺为:料液比1∶2.21，盐酸浓度27.37%，提取时间6.11 h，在此条件下黑色素得率为4.75%。

图5 料液比和提取时间对黑色素得率的影响Fig.5 Response surface plot showing the effects of water/material ratio and extraction time on extraction yield of melanin

图6 盐酸浓度和提取时间对黑色素得率的影响Fig.6 Response surface plot showing the effects of the concentration of hydrochloric acid and extraction time on extraction yield of melanin

3.3 模型验证实验

称取乌骨鸡毛约100 g，结合实际操作情况，将最佳工艺条件修正为:料液比1∶2，盐酸浓度27%，回流提取6 h，重复3次实验取均值对回归模型进行验证，模型验证实验结果见表6。

表6 模型验证结果Table 6 The results of confirmatory test

由表6可知，实测黑色素平均得率为4.72%，该结果与模型预测值基本相符。

3.4 验证性实验所得黑色素粗品中黑色素含量的测定

验证性实验所得黑色素粗品中黑色素含量的测定结果见表7。

表7 样品中PTCA得率及黑色素含量Table 7 The yield of PTCA and the content of melanin in the sample

4 讨论

本实验以黑羽乌骨鸡毛为试材，利用盐酸水解法提取黑色素，在单因素实验基础上，采用响应面分析方法得到了与乌骨鸡毛中黑色素提取工艺实际拟合程度较高的模型以及优化的乌骨鸡毛中黑色素的提取工艺条件:料液比1∶2(g∶mL)，酸浓度27%，提取时间6h，在此条件下乌骨鸡毛中黑色素得率为4.72%。提取的黑色素样品经氧化处理，HPLC检测，样品中 PTCA得率为 12.27%，黑色素含量为76.20%。

朱方［10］以乌骨鸡肌肉为材料，用盐酸回流法提取黑色素，工艺条件为提取温度95℃，料液比1∶4(g∶mL)，时间2h，其乌骨鸡黑色素得率为0.458%，与之方法相比，本实验提高了热回流的温度、HCl的浓度及提取时间，所得样品中黑色素平均得率提高了约10倍;林霖［11］同样以乌骨鸡肌肉为材料，用酶法提取黑色素，其样品中黑色素含量为63.19%，与其结果相比，本实验所得样品中黑色素平均含量提高了13%。因此从废弃的乌骨鸡毛中提取黑色素，不仅降低了黑色素的生产成本，而且能变废为宝，为黑色素的进一步开发利用提供了参考依据。

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