猪骨泥功能性双菌发酵*

秦斌钰，诸葛斌，方慧英，宗红，孙进，龚星慧，楼笑笑，诸葛健

1(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，工业微生物研究中心，江苏无锡，214122)2(浙江正味食品有限公司，浙江省调味食品制造工程技术研究中心，浙江义乌，322000)

动物骨头是一种重要的肉类加工副产物，它含有大量的蛋白质、脂质、矿物质等营养成分，而且含有构成蛋白质的所有氨基酸，氨基酸比例平衡，必需氨基酸含量高;鲜骨中含有大量的钙磷盐，钙磷比值接近2∶1，是人体吸收钙磷的最佳比例，同时还含有无机盐、维生素等，可以说骨头是一种名副其实的营养源。我国是世界肉食消费量第一大国，每年产生近2 000万t的各类畜禽骨头，除排骨和腔骨可以直接用于饮食外，其它骨头均没有得到充分利用，造成巨大浪费。

目前骨类的加工多采用商品酶水解骨蛋白的方法。Michel Linder等利用酶解回收了小牛骨蛋白［1］;赵胜年等利用胰蛋白酶分别对鲜牛骨骼进行了研究并确定了最适酶解工艺［2］。酶法水解在一定程度上了达到了改造利用骨泥的效果［12］，但该法生产成本高，易产生苦味氨基酸，对产品品质有很大影响，并且无法利用骨中富含的钙。

骨头中的钙质多以羟基磷灰石结晶存在，不易吸收利用，采用微生物发酵的方法可提高骨泥中钙的利用率［4］。陈黎洪等以干酪乳杆菌CICC20296深层液态发酵方式提高了乳酸钙的含量［3］。仅采用乳酸菌发酵可获得可溶性钙，但会造成骨泥中蛋白质的极大浪费。

本研究提出采用双菌发酵生产功能性骨泥高值产品的途径，利用安全菌株枯草芽孢杆菌［5］和植物乳杆菌混菌发酵的协同作用，在提高骨泥中可溶性钙含量［6，11］的同时将骨泥中大分子蛋白转化为易于吸收的功能性多肽［10］和人体所必需的游离氨基酸［7，9］，为实现骨泥的最大利用提供一条新思路。

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)AB4、植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)M5从大曲分离，江南大学微生物研究中心保藏。

1.2 原料

新鲜猪骨:猪肩胛和猪肋骨;预处理方法:新鲜猪骨洗净切块，－40℃冷冻1 h。于高速粉碎机中研磨至泥状，收集备用。

1.3 培养基

骨泥发酵培养基(g/L):骨泥250，NaCl 8.5。

1.4 检测方法

(1)水解度的测定［13］。

(2)鲜味氨基酸的测定(高效液相法)［8］。

(3)可溶性钙的测定:参照GB－T－5009.92－2003－食品中钙的测定。

2 结果与分析

2.1 单、双菌发酵骨泥水解度分析

由图1可以看出，双菌发酵24 h，水解度达到37.9%，是未发酵骨泥(经同样处理未接菌的骨泥)的15.2倍，B.subtilisAB4单独发酵骨泥的1.32倍，L.plantarumM5单独发酵骨泥的3.1倍。枯草芽孢杆菌分泌有中碱性蛋白酶，植物乳杆菌分泌酸性蛋白酶，双菌发酵蛋白酶系多样，故双菌发酵比单菌发酵的水解度高。

图1 单、双菌发酵骨泥蛋白水解度Fig.1 Protein hydrolysis degree of single and double bacterium fermentation

为了进一步考察水解后蛋白分子质量分布，进行蛋白电泳。由图2可以看出，未发酵骨泥中蛋白分子质量分布广，枯草芽孢杆菌杆菌单独发酵后，大分子蛋白被降解为44.3 kD以下的蛋白，蛋白分子质量显著下降，双菌发酵后，分子质量在20.1～29.3 kD的蛋白条带明显减少，表明该区域蛋白亦被降解，故双菌发酵对骨泥中大分子蛋白的降解优于单菌发酵。

图2 单、双菌发酵骨泥SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of single and double bacterium fermentation

经葡聚糖凝胶层析，可以清晰的看出各分子量蛋白分布。发酵前，骨泥中28 kD左右的大分子蛋白所占比例达到82.98%，发酵后骨泥中大于28 kD的大分子量蛋白所占比例显著降低，1～3个氨基酸组成的小肽(分子质量低于400D)所占比例显著上升。双菌发酵后得到的小肽含量最多，分子质量为400D左右的小肽含量达到了67.8%。说明2株菌具有协同作用，产生的蛋白酶系丰富，能充分降解骨泥。

2.2 单、双菌发酵骨泥氨基酸含量分析

进一步考察发酵后骨泥中氨基酸含量的变化。如图4，双菌发酵比单菌发酵的鲜味氨基酸(谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)含量高。因为双菌发酵蛋白酶系多样，酶切方式丰富，发酵后鲜味氨基酸均比单菌发酵含量高。发酵24 h，鲜味氨基酸含量达到1.72 mg/mL，是未发酵骨泥的10.8倍，B.subtilis AB4单独发酵骨泥的1.5倍，L.plantarum M5单独发酵骨泥的3.6倍。

图3 发酵骨泥葡聚糖凝胶层析图谱Fig.3 Sephadex gel chromatography map of fermentated bone pastes

图4 单、双菌发酵骨泥鲜味氨基酸含量Fig.4 Umami amino acids content of single and double bacterium fermentation

由表1可以看出，L.plantarum M5产蛋白酶能力较弱;B.subtilis AB4产蛋白酶能力强，产生的氨基酸含量高，鲜味氨基酸含量上升，但也会导致部分苦味氨基酸含量上升。双菌发酵后，鲜味氨基酸含量比单菌发酵更高，Leu、His和Ile等苦味氨基酸含量明显降低。说明双菌发酵蛋白酶系具有多样性，两株菌协同作用，在提高鲜味氨基酸含量的同时还能降低苦味氨基酸含量。

表1 单、双菌发酵氨基酸含量比较Table 1 Amino acids content of single and double bacterium fermentation

2.3 单、双菌发酵骨泥可溶性钙含量分析

对发酵前后骨泥可溶性钙含量进行测定，如图6，双菌发酵在32 h骨泥可溶性钙含量最高。发酵32 h，可溶性钙含量达到1.16 mg/mL，是未发酵骨泥的29倍，B.subtilis AB4单独发酵骨泥的6.4倍，单独发酵骨泥的1.04倍。

图5 单、双菌发酵可溶性钙含量Fig.5 Soluble calcium content of single and double bacterium fermentation

为了更直观地看出骨泥发酵后的变化，在40倍显微镜下观察发酵前后的骨泥。由图7可以看出，未发酵骨泥边缘厚实，结构致密，经B.sbutilis AB4和L.plantarum M5双菌发酵后骨泥边缘锯齿，疏松多孔。结合水解度、鲜味氨基酸和可溶性钙含量测得的数据，骨泥中蛋白大量水解为可溶性的小分子氨基酸和多肽，溶入到发酵液中，同时钙质大量溶出，可溶性钙含量大幅上升。

图6 发酵前后骨泥表观变化Fig.6 The apparent change after fermentation under microscope

3 结论

骨泥双菌发酵比单菌发酵更具有优势，植物乳杆菌的酸性蛋白酶和枯草芽孢杆菌的中、碱性蛋白酶相辅相成，蛋白酶系多样，酶切方式丰富，水解充分，极大的提高了小肽和鲜味氨基酸的含量，降低了苦味氨基酸的含量，同时发酵后骨泥呈细粉状，疏松多孔，说明可溶性钙增加。双菌发酵后骨泥蛋白水解度达到42.5%，总鲜味氨基酸为2.01 mg/mL，可溶性钙为1.16 mg/mL，分别比未接菌发酵骨泥提高了5.1倍、5.9倍和8.3倍，极大地提高了骨泥的功能性。

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