碳源对圆酵母(Torula sp.)B84512发酵合成赤藓糖醇及副产物甘油的影响*

高慧，窦文芳，陆茂林，许正宏，史劲松

1(江南大学药学院，江苏 无锡，214122)2(江苏省微生物研究所，江苏 无锡，214063)

赤藓糖醇(1，2，3，4-丁四醇)，分子式为 C4H10O4，相对分子质量为122.12。自然界中如海藻、蘑菇等、水果类、发酵食品、微生物中都广泛存在，由于其口感清凉，且具有低热量、低吸湿性及高耐受性［1－2］等特点，成为较受追捧的21世纪功能性食品添加剂。

国际上均采用微生物发酵法大批量生产赤藓糖醇［3－4］，葡萄糖、蔗糖、果糖是主要碳源［5］。耐高渗酵母在耗氧条件下以葡萄糖或蔗糖等为碳源时主要通过HMP途径生成赤藓糖醇［6－7］，即通过磷酸戊糖途径和糖酵解途径产生足够的还原力，生成大量的赤藓糖-4-磷酸，而后在赤藓糖还原酶的作用下脱磷酸生成赤藓糖醇。代谢途径如图1所示，在该途径中亦可以通过1，6-二磷酸果糖转化为甘油，同时研究表明，甘油也是生产赤藓糖醇的良好碳源。Waldemar Rymowicz等人［8］以甘油为碳源，发酵7天赤藓糖醇的产量为170 g/L，产率为1 g/(L·h)。以甘油为碳源合成赤藓糖醇的主要代谢途径是在甘油激酶(Gut1p)作用下催化甘油生成3-磷酸甘油(G3P)，再在线粒体中依赖FAD+的3-磷酸甘油脱氢酶(mtGPD)的催化下还原生成磷酸二羟丙酮(DHAP)。磷酸二羟丙酮在磷酸丙糖异构酶(pPI)的作用下异构化为3-磷酸甘油醛(GA3P)。3-磷酸甘油醛和果糖-1，6-二磷酸相互作用又可以生成木酮糖-5-磷酸和赤藓糖-4-磷酸［9－11］，继而脱磷酸生成赤藓糖醇。

图1 酵母体内赤藓糖醇代谢途径Fig.1 The metabolic of erythritol in yeast

江苏省微生物研究所吴燕、杨晓伟等人［12］从土壤中筛选出1株产赤藓糖醇的耐高渗菌株圆酵母B84512，并对其发酵过程培养基及培养条件进行了优化，但只针对不同糖浓度进行了研究，未涉及不同碳源对赤藓糖醇合成的影响。本文在前期研究的基础上，探讨圆酵母B84512利用不同碳源及在补料发酵生成赤藓糖醇的过程中主要副产物甘油的生成情况。通过对甘油生成与消耗代谢过程中关键酶酶活分析，旨在阐明圆酵母B84512内甘油生成途径，为甘油途径基因敲除奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

圆酵母(Torula)B84512，由江苏省微生物研究所筛选。

1.1.2 试剂

赤藓糖醇标准品、磷酸二羟丙酮(DHAP)、DL-α-磷酸甘油为sigma公司标准品，其他均为分析纯试剂。

1.1.3 培养基

种子培养基:葡萄糖20%，酵母粉1%，尿素0.1%，CuSO4·5H2O 0.001%，MnSO4·H2O 0.001%，pH 6.0。

固体斜面培养基加2%琼脂粉。

补料分批发酵培养基:葡萄糖 30%，酵母粉1%，尿素 0.1%，CuSO4·5H2O 0.001%，MnSO4·H2O 0.001%，pH 6.0。当糖降至20%左右时补加80%葡萄糖至总糖浓度达到40%、50%及60%。

1.2 实验方法

1.2.1 菌体培养

将甘油管保藏菌株接种于10 mL YPD培养基中，往复式摇床30℃，200 r/min培养2 d后，用接种环挑取，1环菌液在斜面培养基中划线，30℃培养箱恒温培养3 d。挑取新鲜斜面菌株接种于10 mL种子培养基中，30℃，200 r/min培养2 d后转接至二级种子培养基，继续培养1 d后即可用于后续的发酵试验。

1.2.2 不同碳源发酵对赤藓糖醇及甘油的影响

分别以蔗糖、果糖、山梨醇、葡萄糖和甘油为碳源，按照1.2.1的培养方法进行菌体培养，发酵过程每隔10 h取样，测定菌浓、残糖以及赤藓糖醇和甘油的量。

1.2.3 甘油和葡萄糖对圆酵母B84512合成赤藓糖醇及甘油的影响

以初始浓度为30%的甘油为碳源发酵产赤藓糖醇，按照1.2.1的培养方法进行菌体培养，测定甘油的消耗情况和赤藓糖醇的生成情况，并与葡萄糖为碳源时进行比较。

1.2.4 发酵过程补加葡萄糖及补料终浓度对赤藓糖醇的影响

以初始浓度为30%葡萄糖为碳源，按照1.2.1的方法培养菌体，当葡萄糖浓度降至20%左右补加浓度为80%的葡萄糖使总糖分别达到40%、50%及60%。发酵过程中定时取样，考察对赤藓糖醇产量的影响及副产物甘油的变化情况。

1.2.5 用于酶活测定细胞粗提物的制备

发酵液样品12 000 r/min，4℃，离心10 min收集菌体，用预冷的渗透压相同的破壁缓冲液洗涤1次，再重悬于破壁缓冲液(100 mmol/L pH7.5磷酸盐缓冲液，含 1 mmol/L DTT，2 mmol/L MgCl2)中，称取等量的湿菌体按质量比为(1∶8)～(1∶10)的比例用破壁缓冲液悬浮，4℃超声破碎(工作3 s，间隔6 s)2 h，未破碎的细胞于4℃，10 000 r/min离心20 min去除，上清液即为用于酶活测定的粗酶提取物。

1.2.6 胞浆3-磷酸甘油脱氢酶酶活测定

反应体系包括20 mmol/L、pH 7.0咪唑-HCl缓冲液、1mmol/L DTT、1mmol/L MgCl2、0.09 mmol/L NADH和0.67 mmol/L DHAP组成，30℃反应1 min后，以加入DHAP为0时，线性范围为5 min，340 nm处测定30 s和120 s时吸光度。定义:30℃下1 min消耗1 μmol/L NADH所需的酶量为1个酶活单位(U)。

1.2.7 3-磷酸甘油酯酶酶活测定

取酶液50 μL加入0.2 mol/L DL-α磷酸甘油10 μL，1 mol/L、pH 7.0 咪唑 10 μL，0.25 mol/L MgCl210 μL，再加入 20 μL 超纯水，使总体积为 0.1 mL。30℃水浴反应至所需时间后加入2 mL 5%三氯乙酸终止反应，振荡并于10 000 r/min离心10 min，取上清液测定无机磷含量。在30℃，pH 7.0条件下，每分钟催化3-磷酸甘油生成1 μmol磷酸根所需的酶量为1个酶活单位(U)。

1.2.8 线粒体3-磷酸甘油脱氢酶酶活测定

反应体系组成为:0.5 mol/L、pH 7.6 Tris，0.05 mol/L DL-α-磷酸甘油，1 mg/mL MTT，1 mg/mL PMS。酶促反应温度为30℃。在550 nm处测定MTT还原产物，用8.1×103M－1cm－1摩尔消光系数来计算底物转化速率。将1 min还原1 μmol MTT定义为1个酶活单位(U)。

1.3 分析方法

1.3.1 发酵液中赤藓糖醇和甘油的HPLC测定

色谱条件:色谱柱为Alltech Prevail Carbohydrate ES(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相为乙腈∶水(75∶25);流速为1.0 mL/min;RI 2000型示差折光检测器;柱温为30℃。

1.3.2 发酵液中葡萄糖的测定

3，5-二硝基水杨酸法。

1.3.3 菌体生物量测定

将样品稀释至合适浓度后在600 nm处测定紫外吸收值。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源发酵对赤藓糖醇和甘油产量的影响

如图2－A所示，葡萄糖为碳源，赤藓糖醇产量最高，为115 g/L;其次为果糖和蔗糖，赤藓糖醇产量为83 g/L和71 g/L;以山梨醇为碳源，赤藓糖醇产量最低，仅为28 g/L。此外，发酵过程中都伴随着副产物甘油的产生。从图2－B可以看出，发酵初期至中期甘油不断积聚，以葡萄糖和果糖为碳源时，甘油的产量最高，分别达到54 g/L和52 g/L;以蔗糖、山梨醇及甘露糖为碳源时，甘油的产量较少，分别为22 g/L、21 g/L及25 g/L。可以看出，葡萄糖为圆酵母B84512发酵产赤藓糖醇的最适碳源，蔗糖、果糖次之，山梨醇最差。但任何碳源在发酵过程中均会产生甘油，且在发酵中后期甘油逐渐被消耗，推测甘油极有可能被作为碳源用于合成赤藓糖醇，故研究圆酵母B84512发酵生成赤藓糖醇的过程中甘油的生成情况十分必要。

图2 不同碳源对圆酵母B84512发酵产赤藓糖醇及甘油影响Fig.2 The production of erythritol and glycerol with different carbon hydrate

2.2 甘油和葡萄糖对圆酵母B84512合成赤藓糖醇及甘油的影响

在上述研究的基础上，比较了甘油和葡萄糖作为碳源对圆酵母B84512发酵生成赤藓糖醇的影响。从表1可以看出，以甘油为碳源时碳源的消耗速率及赤藓糖醇的生成速率分别为1.58 g/(L·h)和0.61 g/(L·h)，而以葡萄糖为碳源时碳源消耗速率为3.33 g/(L·h)，赤藓糖醇的生成速率为0.96 g/(L·h)。且以葡萄糖为碳源时赤藓糖醇的得率也较甘油高。因此，圆酵母B84512以葡萄糖为碳源合成赤藓糖醇的效率明显优于甘油。

表1 甘油和葡萄糖为碳源对圆酵母B84512发酵产赤藓糖醇情况比较Table 1 Comparison of erythritol fermentation performance by different carbon sources such as glycerol and glucose

2.3 葡萄糖补加对圆酵母B84512合成赤藓糖醇及甘油的影响

以前期研究为基础，尝试通过发酵过程中补加葡萄糖，以增加赤藓糖醇的产量并减少主要代谢副产物甘油的生成。控制分批补料发酵的初始葡萄糖浓度为30%，当葡萄糖浓度降低至20%左右补加葡萄糖，补料至不同终糖浓度发酵过程比较如图3所示(包括葡萄糖消耗、菌浓、赤藓糖醇生成及甘油变化)。总糖为40%时发酵250 h赤藓糖醇的产量达到225 g/L，产率为0.9 g/(L·h)。终糖浓度为50%时发酵260 h赤藓糖醇的产量提高到了253 g/L，产率为1.03 g/(L·h)。而补加葡萄糖至终浓度为60%是赤藓糖醇产量仅为230 g/L，产率为0.85 g/(L·h)(图3－A中箭头所指方向为流加葡萄糖点)。

发酵过程中补料并不能抑制甘油的生成，反而与葡萄糖浓度呈正相关。葡萄糖终浓度为40%时甘油的产量最高可达到102 g/L，葡萄糖终浓度为50%和60%时甘油产量分别达到145 g/L和189 g/L。但如图D所示，发酵中后期葡萄糖被消耗完，甘油量逐步降低，赤藓糖醇产量持续增长。以甘油为碳源合成赤藓糖醇的速率较分别为0.86 g/(L·h)、0.95 g/(L·h)和0.73 g/(L·h)，均低于以葡萄糖为碳源时赤藓糖醇的合成速率。此外，由于甘油的合成及分解代谢导致发酵周期延长，因此必须阻断甘油合成途径的关键酶以提高赤藓糖醇的产率。

图3 不同补料终浓度对圆酵母B84512发酵产赤藓糖醇及甘油过程比较Fig.3 Comparison of erythritol fermentation performance by feding-batch glucose to different concentration

2.4 发酵过程中胞浆3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油酯酶和线粒体3-磷酸甘油脱氢酶酶活表征

通过测定胞浆3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油酯酶和线粒体3-磷酸甘油脱氢酶酶活以确定甘油合成途径关键酶，以验证文献报道［11］的甘油合成及分解途径是否适用于圆酵母B84512。从表2可以看出，在整个甘油发酵过程中，圆酵母B84512皆具有较高的ctGPD酶活并在80 h时出现酶活峰值;发酵过程中80 h内一直积累甘油，100 h后甘油开始消耗，ctGPD也进入低水平阶段。而在80 h内，GPP的酶活一直处于高水平，也在80 h出现峰值。这一特征与圆酵母B84512以最高速率积累甘油在时间上吻合。在发酵过程中细胞中的GPP活性远高于ctGPD，显然，在由葡萄糖分解形成磷酸二羟丙酮，再在ctGPD的催化下还原为3-磷酸甘油，而后在GPP的催化下水解生成甘油的代谢途径中，ctGPD成为圆酵母B84512甘油合成的限速酶，ctGPD的活力水平决定了甘油的合成和积累水平。

表2 甘油合成与消耗关键酶活力与甘油生成消耗速率及葡萄糖消耗关系Table 2 Specific activities of key enzyme and specific rate of glycerol and glucose formation and consumption in Torula sp.B84512

从表2可以看出，圆酵母B84512在甘油发酵的早期及中期几乎无mtGPD酶活或酶活很低，糖浓度降至40 g/L以下mtGPD酶活迅速增加，此时mtGPD开始被诱导。随着mtGPD的诱导，发酵液中的甘油含量开始下降，到发酵末期甘油消耗完毕，mtGPD酶活已经很低。mtGPD在葡萄糖存在时受到葡萄糖代谢过程中1，6-二磷酸果糖的抑制，而甘油则能诱导它的表达。100 h mtGPD酶活增加说明甘油开始大量向磷酸二羟丙酮方向生成，继而生成赤藓糖醇。

3 讨论

对圆酵母B84512的发酵过程研究结果如下:葡萄糖是产赤藓糖醇的最佳碳源。发酵过程中补加葡萄糖至终浓度为50%，赤藓糖醇的产量最高，发酵260 h赤藓糖醇的产量为253 g/L，产率为1.03 g/(L·h)。此外，发酵过程中伴随着副产物甘油的生成，通过对甘油合成代谢及分解代谢过程中关键酶包括胞浆3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油酯酶和线粒体3-磷酸甘油脱氢酶酶活分析，发现发酵80 h内ctGPD及Gpp酶活持续增加且均在80 h达到峰值，这与80 h时甘油达到最高积累速率相符合。而在80 h内mtGPD酶活一直较低，受到1，6-二磷酸果糖的抑制，直到葡萄糖浓度降至40 g/L时才被甘油诱导。甘油在甘油激酶及线粒体3-磷酸甘油脱氢酶的作用下生成磷酸二羟丙酮，而后生成赤藓糖醇。

虽然甘油可以再次分解生成赤藓糖醇，但大大地延长了发酵时间，这在工业生产中是不经济的。在合成甘油的代谢支路中，胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)是合成途径中关键酶。因此，下一步计划对该酶进行基因敲除，减弱向甘油合成途径的流量，缩短发酵周期，增加赤藓糖醇的生成速率。

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