胶束增敏荧光光度法测定兔血样中阿霉素

钱 帆，付玉丽，程秀梅，廖秀林，杨秀培

（西华师范大学化学化工学院，四川 南充 637000）

0 引 言

阿霉素（DOX）是一种有效的抗癌药物，被广泛用于癌症的化疗，且已被美国药典收录[1]。在化疗过程中，DOX有严重的副作用，当用量超过550mg/m2时，就会有大于18%的概率出现不可逆的心脏毒性[2]；因此，DOX在临床上应正确使用并严格控制用量。应用一种简单、快速且灵敏的方法进行监控及其药物代谢研究也是非常必要的。图1显示了DOX的化学结构，其本身具有一定的紫外吸收及荧光性能。目前，测定DOX的方法有光谱法[3]、伏安法[4]、差示极谱法[5]、毛细管电泳法[6]及液相色谱法[7]等，其中，荧光法具有方便、快速的特点，被广泛应用于众多实验室及医疗院所[8]。尽管荧光法测定阿霉素已有文献报道[9-10]，但一般荧光法的灵敏度不能满足临床监测的实际需求；因此，许多学者对提高阿霉素荧光检测的灵敏度进行了研究[11-12]。本文首次提出利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）对阿霉素荧光强度的增敏作用，建立胶束增敏荧光光度法测定DOX的新方法，并应用于兔血样的分析。

图1 阿霉素结构

1 实验部分

1.1 仪 器

RF-5301PC荧光分光光度计（日本岛津公司），Waters液相色谱仪-荧光检测器（美国沃特斯公司），pH酸度计（美国奥豪斯公司），电子天平（美国奥豪斯公司），智能超声波清洗器（上海之信仪器有限公司），离心机（上海卢湘仪）。

1.2 试 剂

盐酸阿霉素（Sigma公司，USA），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、四丁基溴化铵、十二烷基磺酸钠、磷酸盐、乙腈、甲醇、无水乙醇（成都科龙化工试剂厂），十二烷基硫酸钠（天津滨海科迪化学试剂有限公司），硼酸（上海外岗化工二厂），所用试剂均为分析纯或以上，实验用水均为三次水。

1.3 标准溶液及兔血样的制备

标准溶液的配制：配制质量浓度为1.0mg/mL的阿霉素储备液，放置于4℃下保存。每次实验前准确移取适量的储备液，配制所需阿霉素标准溶液。

兔血样的制备：将1.2mL兔血清移入5mL离心管中，加入一定量的阿霉素标准溶液，再加入1.2mL乙腈，于高速离心机中离心去蛋白。取离心后的上层清液，再加入CTAB和硼酸缓冲溶液-乙醇混合液定容，随后进行测定。

1.4 实验步骤

将一定量的阿霉素标准溶液、一定量的CTAB溶液和硼酸缓冲溶液加至10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀后测定其荧光强度。用1mL的石英比色皿，以480 nm的波长激发，测定发射光谱的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 荧光波长的选择

分别测定浓度为75ng/mL的阿霉素在硼酸缓冲溶液及CTAB-乙醇-硼酸缓冲液混合体系中的荧光光谱，如图2所示。阿霉素的最大激发波长与最大发射波长分别为480 nm和593 nm。两种体系看来，CTAB及乙醇的加入对最大发射波长没有多少影响，但对阿霉素的荧光强度有明显增强。本实验选择的激发波长与发射波长分别为480nm和593 nm。

图2 阿霉素在不同体系中的荧光光谱

2.2 表面活性剂种类的选择

分别比较了十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、四丁基溴化铵、十二烷基硫酸钠和十二烷基磺酸钠等表面活性剂对阿霉素（5.0 ng/mL）荧光强度的影响，如图3所示。几种表面活性剂中，CTAB对阿霉素荧光有增强作用，故选CTAB作为增敏剂。

2.3 CTAB浓度的优化

详细考察了0～2.5mmol/L CTAB的浓度对阿霉素（7.5 ng/mL）荧光强度的影响，其他条件均为优化值。如图4所示，当CTAB的浓度小于1.9mmol/L，阿霉素的荧光强度随着浓度的增加先剧烈增大然后变缓，当CTAB的浓度大于1.9mmol/L，阿霉素的荧光强度随着浓度的增加而降低。这可能是因为CTAB浓度在小于1.1mmol/L达到其胶束浓度值时，溶液中的游离氧对荧光强度有一定的猝灭作用，随着CTAB浓度的增加，溶液中的游离氧则逐渐下降，从而减小了溶解氧对荧光的猝灭作用；浓度大于1.1mmol/L后，CTAB浓度大于其临界胶束浓度而在溶液中形成胶束，降低了阿霉素分子活动的自由度，从而减少了与其他溶剂或溶质分子的碰撞猝灭作用；但当CTAB浓度大于1.9mmol/L时，可能体系过高的黏性导致荧光强度反而下降。因此，CTAB的最佳浓度确定为1.9mmol/L。

图3 不同表面活性剂对阿霉素荧光强度的影响

图4 CTAB的浓度对阿霉素荧光强度的影响

2.4 缓冲溶液的pH值及浓度对阿霉素荧光强度的影响

本实验对硼酸缓冲液的pH值及浓度作了考察。图5和图6分别显示了硼酸缓冲液pH值及浓度对阿霉素（5.0 ng/mL）荧光强度的影响，其他条件均为优化值。当pH值小于6.0时，荧光强度随着pH的增大而增大，当pH值大于6.0时，荧光则逐渐的降低。这是因为阿霉素在碱性及过酸条件下不稳定，碱性过强时甚至结构会被破坏，因此，在随后的实验中，6.0作为缓冲溶液的最佳pH值。从图6可以看出，缓冲液浓度为17mmol/L时可以得到最大荧光强度；因此，选择17mmol/L pH为6.0的硼酸缓冲溶液进行实验。

2.5 乙醇含量的影响

实验中发现添加一定的乙醇会增强阿霉素的荧光，随后考察了乙醇含量（0%～80%，v/v）对阿霉素（10.0 ng/mL）荧光强度的影响，其他条件为优化值，如图7所示。在含量为60%以下时，阿霉素的荧光随乙醇含量的增加而增强，然而当大于60%时，阿霉素荧光急剧减弱；因此，乙醇含量确定为60%（v/v）较为适宜。

图5 缓冲液pH对阿霉素荧光强度的影响

图6 缓冲液浓度对阿霉素荧光强度的影响

图7 乙醇含量对阿霉素荧光强度的影响

2.6 线性范围与检出限

在480nm的激发波长下，测定不同浓度的阿霉素混合体系（pH=6.0，17mmol/L硼酸缓冲液含60%乙醇（v/v）、1.9mmol/L CTAB）。得到标准曲线方程为

式中：F——体系荧光强度；

c——阿霉素浓度，ng/mL。

线性范围为0.5～120 ng/mL，测得检出限为0.161ng/mL（3S/N，n=10）。该灵敏度比同类文献[13]报道的6.3×10-8mol/L约提高了两个数量级。

2.7 加标回收率的测定

兔血取于市场上健康的家兔，在实际兔血样中没有检出阿霉素，因此将不同阿霉素加标量的兔血样品进行去蛋白处理后，采用如上荧光法进行回收率测定试验，结果如表1所示。其回收率在93.7%～105.6%之间，相对标准偏差RSD为1.1%～1.5%，说明该方法具有较高的准确度。

表1 加标回收率测定结果（n=5）

2.8 与高效液相色谱法对比

药典[14]中收录的阿霉素检测方法为高效液相色谱-紫外检测法，该方法灵敏度较低，其线性范围的下限要大于新方法线性范围的上限，无法很好准确的进行方法对比，因此本工作采用文献[7]中报道的高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）来测定加标兔血样品来对比验证新方法的准确度。色谱柱为反相Nucleosil C18柱，流动相为甲醇与0.01mol/L磷酸盐缓冲液的混合液（65∶35，v/v；pH 2.96），流速为2mL/min，检测的激发波长与发射波长分别为480nm和593nm，进样量为20μL。表2中给出了所提新方法及HPLC-FLD法对加标兔血样的测定结果，证明了新方法可替代HPLC法用于临床阿霉素含量的快速测定。

表2 CE及HPLC法测定加标兔血样结果（n=5）

3 结束语

本文研究了硼酸缓冲液pH值及浓度、有机溶剂和CTAB浓度等条件对体系荧光强度的影响，建立了兔血清中阿霉素表面活性剂增敏荧光光谱测定方法。结果显示，在硼酸缓冲液pH=6.0、浓度为17mmol/L且含 60%乙醇（v/v）、1.9mmol/L CTAB 的条件下，体系荧光强度在0.5～120 ng/mL有良好的线性关系，且检测限为0.161ng/mL，测定实际样品的相对标准偏差为1.1%～1.5%，回收率在93.7%～105.6%，该法可用于临床阿霉素含量的快速测定。

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