UPLC同时测定决明子中橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量

2013-05-03徐超群

中国测试 2013年2期

詹雁，阮佳，谭镭，徐超群

（四川省中医药科学院，四川成都 610041）

0 引言

决明子为常用中药，来源于豆科植物决明（cassia obtusifolia L.）和小决明（cassia tora L.）的干燥成熟种子[1]，始载于《神农本草经》，具有清热明目、润肠通便的功效，用于目赤涩痛、羞明多泪、头痛眩晕、目暗不明、大便秘结等症，其主要有效成分为蒽醌类化合物[2]。目前，决明子中蒽醌类化合物检测常用方法主要有分光光度法[3-4]、高效液相色谱法[5-9]。与分光光度法相比，高效液相色谱法稳定性、准确度和重现性更好，但是对于多种成分的同时测定花费时间过长；为此，本文建立了超高效液相色谱法（UPLC），4min内可完成橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的分析检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC（美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower2色谱工作站）；BP210S电子天平（德国Sartorius公司）；AB135-S 1/10万天平（METTLER TOLEDO仪器有限公司）。

乙腈（色谱纯，美国Sigma公司）；水（乐百氏纯净水）；磷酸、甲醇、盐酸、三氯甲烷（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。

决明子药材（四川利民中药饮片有限公司，四川新荷花中药饮片股份有限公司，四川省中药饮片有限责任公司）；橙黄决明素（批号：111900-201202）、大黄酚（批号:110796-201118）、大黄素（批号：110756-200110）、大黄素甲醚（批号：110758-200610）（中国药品生物制品检定所）。

1.2 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1mm×50mm×1.7μm，美国Waters公司）；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为284nm；柱温为30℃；流速为0.6mL/min；进样量为2μL。

表1 梯度洗脱程序

1.3 样品制备

精密称取橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，用甲醇制成含橙黄决明素30.02μg/mL、大黄素25.00μg/mL、大黄酚104.30μg/mL和大黄素甲醚59.16μg/mL的混合标准品储备液。分析测试中所用标准溶液由标准品储备液逐步稀释得到。

取决明子药材粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，蒸干，加稀盐酸30mL，置水浴中加热水解1h，立即冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用甲醇使溶解，转移至25mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用0.2μm有机过滤膜过滤，取续滤液作待测样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

分别精密移取混合标准品储备液1.0，2.0，4.0，7.0，10.0mL置于10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，进样测定，以各成分峰面积为纵坐标Y，质量体积浓度（μg/mL）为横坐标X，绘制标准曲线，如表2。结果显示各标准曲线线性关系良好。

表2 标准工作曲线

2.2 精密度

取含橙黄决明素12.008μg/mL、大黄素10.000 μg/mL、大黄酚41.720μg/mL和大黄素甲醚23.664 μg/mL的混合标准品溶液，重复进样5次，计算橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.22%，1.05%，1.53%，1.60%，色谱图见图1，说明本UPLC方法下仪器精密度良好。

2.3 重复性

取同一批号的决明子药材6份，按1.3方法制备样品溶液，测定，计算橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD分别为1.52%，1.27%，1.61%，1.83%，重复性良好。

2.4 稳定性

取同一样品溶液，于室温下 0，2，4，6，8，12，24 h分别进行测定，以峰面积为指标计算橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为1.15%，1.34%，1.66%，1.76%，说明样液在24h内稳定。

图1 混标图谱（UPLC）

图2 样品图谱(UPLC)

图3 样品图谱(HPLC)

2.5 加样回收率

精密称取0.25 g已知含量的决明子药材粉末（过三号筛），共9份，分别精密加入混合标准品储备液8，10，12mL，按1.3方法制备样品溶液，测定，回收率较好，结果见表3。

表3 回收率试验

2.6 样品测定

图2为样品溶液的色谱图，在本色谱条件下，4种被测成分与其他化合物色谱峰分离度均良好。对6批次决明子药材进行测定，结果见表4。

2.7 与HPLC测定方法的比较

建立以下HPLC色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6mm×250mm×5μm，美国 Agilent公司）；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相 B，分别在 A∶B=4∶6 和 A∶B=9∶1 时进行梯度洗脱15min；检测波长为284 nm；柱温为30℃；流速为1.0mL/min；进样量为5μL。在此色谱条件下，对样品溶液进行测定，结果显示4种待测成分的分析时间至少需要32min，测得含量与UPLC法一致，色谱图见图3。