肉制品中3,4-苯并（α）芘检测方法的改进

曾习文 李 宏 夏立新 彭新凯 杨彦宁 黎 瑛

ZENG Xi-Wen1 LIHong2 XIA Li-Xin1 PENG Xin-Kai1 Y ANG Yan-Lin1 LIYing1

（1.长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410013；2.北京东方凯姆质量认证中心，北京 100021）

(1.Changsha Center of Supervision and Inspecetion on Food Quality Safety,Changsha,Hunan 410013,China;2.Beijing CAM Quality Certification Center,Chaoyang District,Beijing 100021,China)

3 ,4-苯并（α）芘又称苯并芘（benzopyrene），是一种由5个苯环构成的多环芳烃，其性质稳定，不溶于水，溶于苯、氯仿、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，是一种很强的致癌物质，可诱变皮肤、肺和消化道癌症[1-3]，并有一定的致畸作用[4]。

熏烧烤肉深受消费者喜爱，但在烟熏、烧烤、油炸肉制品过程中，会产生致癌物质3,4-苯并(α)芘[5,6]。现有检测方法主要有高效液相色谱—荧光检测器法[7-9]，气相色谱—质谱法[10-12]，气相色谱—高分辨质谱法[13]，紫外分光光度法[14]，但其前处理都存在不同程度的缺陷，以致在实际工作中很难开展。

胡奇杰等[6]采用正己烷提取结合C18小柱固相萃取净化法对肉制品进行前处理，这种方法的优点在于对样品净化时不需要繁琐的操作，但使用了比较昂贵的C18固相萃取小柱，使得检测成本显著上升；中国NY/T 1666——2008中采用环己烷提取结合二甲亚砜—环己烷反提净化法对肉制品进行前处理，这种方法不需要昂贵材料（C18固相萃取小柱），但是操作过程繁琐，且可操作性很差，不利于对大量样品进行同时处理。本试验在前人的研究基础上，改进了肉制品中苯并芘检测的前处理方法，采用安全性更高的乙酸乙酯作为提取溶剂，通过提取、浓缩、再反提净化的方法，结合高效液相色谱—荧光检测器对肉制品中苯并芘残留实现快捷有效的测定，大大节省了检测时间及检测成本，同时减少了对环境的污染，真正意义上实现了环境友好型检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

甲醇、乙腈：色谱纯，美国默克公司；

乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、石油醚、环己烷、正己烷、无水硫酸钠、三氧化二铝：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

苯并(α)芘标准品：10 μg/mL，国家标物中心。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（带荧光检测器）：LC-20AT型，岛津公司；

旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；

超声波清洗机：SB-25-12DT型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

离心机：CT14D型，上海天美生化仪器设备工程有限公司；

氮吹仪：HGC-24A型，北京晨曦勇创科技有限公司；

电子天平：AL204型，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；

固相萃取小柱：C18型，美国沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 标准贮备液及标准使用溶液的配制 将1mL标准品（10μg/mL）加入到10mL棕色容量瓶中，甲醇定容得浓度为1μg/mL的标准贮备液（A液），0～5℃避光保存。分别吸取定量A液于10mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成0.0，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，100.0 ng/mL 标准使用溶液。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse PAH 4.6×250mm，5μm；流动相：A为超纯水，B为色谱纯乙腈；采用等度洗脱（乙腈∶水=90∶10），洗脱时间：20min；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；荧光检测器激发波长为384 nm，检测波长为406 nm；以色谱峰面积外标法定量。

1.3.3 样品处理 取肉制品，切碎，搅拌机捣碎，称取10 g左右样品于50mL离心管中，加入2 g无水硫酸钠，20mL乙酸乙酯，涡旋混匀1min，超声提取10min，10 000 r/min离心3min，倾出上清液，20 mL乙酸乙酯重复提取1次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干，5mL石油醚转移浓缩液至10 mL比色管中，氮吹至干，加入2mL甲醇，涡旋1min，0.45μm尼龙滤膜过滤后上机测定。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

以往的文献[6]和标准[15]中，提取溶剂都限于石油醚、环己烷、正己烷等极性很小的溶剂，虽然这些溶剂对苯并芘溶解性都很好，但对肉制品中苯并芘的提取能力如何还没有人进行过考究。一种好的提取溶剂应该具备两个特点：①对目标物要有良好的溶解性，②溶剂要具有对样品良好的渗透能力。为了找到更加适合肉制品中苯并芘残留提取的有机溶剂，对不同极性有机溶剂提取能力进行了比较。结果见表1。

不同溶剂提取效果试验结果显示，提取能力二氯甲烷最强，乙酸乙酯次之，这可能与二氯甲烷、乙酸乙酯强的渗透力（对样品）及良好的溶解性（对目标物）有关。由于二氯甲烷毒性较大，对人体有很大危害且价格较乙酸乙酯昂贵，综合考虑环保和经济因素，最终选择乙酸乙酯作为提取肉制品中苯并（α）芘的溶剂。

2.2 净化条件的选择

取同一批次阴性肉制品，切碎，搅拌机捣碎，称取样品（10±0.01）g，5 个平行，3 种标样添加水平（5，50，500 ng）。样品置于50mL离心管中，加入2 g无水硫酸钠，加入20mL乙酸乙酯，涡旋混匀1min，超声提取10min，10 000 r/min离心3 min，倾出上清液，20 mL乙酸乙酯重复提取1次，合并提取液，旋蒸浓缩至近干，5mL石油醚转移浓缩液至10mL比色管中，氮吹至干。分别选用C18小柱固相萃取法、甲醇反提法、乙腈反提法、中性氧化铝过柱法、二甲亚砜—环己烷反提法5种方法分别对乙酸乙酯超声提取浓缩物进行净化处理，所得结果见表2。

表1 不同溶剂提取样品中3,4-苯并(α)芘结果对比Table1 Resultsabout3,4-benzo(α)pyrene in sampleby different reagentextracting

表2 不同净化方式结果对比Table2 Resultsweregiven by differentpurifyingmethod

试验结果显示：操作性方面，甲醇反提法与乙腈反提法占优势，而C18小柱固相萃取法、中性氧化铝过柱法[15]及二甲亚砜—环己烷反提法均需要复杂的处理过程，在对大量肉制品进行前处理时明显不适应；回收率方面，用中性氧化铝过柱法净化时回收率最高（90.3%），甲醇反提法次之（87.7%），乙腈反提法（81.5%），二甲亚砜—环己烷反提法及C18小柱固相萃取法较差。中性氧化铝过柱法操作繁琐且需要使用大量溶剂，对环境会造成一定程度污染，同时成本也相对较高；而乙腈反提法回收率（81.5%）较甲醇反提法要低（87.7%），并且乙腈价格高于甲醇，对环境的污染也较大。综合考虑成本及环境因素前提下，最终选择甲醇反提法作为肉制品中苯并芘检测的净化方法。分析认为甲醇反提能达到净化的目的与甲醇对油脂的溶解性不好，对目标化合物苯并芘有一定溶解性，且在油脂中的渗透性较好有关，也就为浓缩液净化提供了方便。

2.3 检测方法比对

为了得到一种简便、快捷、经济、环保的肉制品中苯并芘残留量检测方法，需要对现有报道方法[6,15]进行改进，并将改进后的方法与前人报道方法进行比对，所得结果见表3。

3 种方法测定肉制品中苯并芘含量时：胡奇杰等[6]采用正己烷提取结合C18小柱固相萃取净化法对肉制品进行前处理，这种方法的优点在于对样品净化时不需要繁琐的操作，但使用了比较昂贵的C18固相萃取小柱，使得检测成本显著上升，且回收率（73.0%）也不太理想，不适合大批量肉制品中苯并芘残留量检测的前处理；中国NY/T 1666——2008中采用环己烷提取结合二甲亚砜—环己烷反提净化法对肉制品进行前处理好，这种方法不需要昂贵的材料(C18固相萃取小柱)，但操作过程繁琐，且可操作性很差，回收率（67.5%）较低，不适于对大量样品进行同时处理。本试验采用乙酸乙酯超声提取、旋蒸浓缩、甲醇反提净化对肉制品进行前处理，其操作过程简便，检测成本低廉，对环境污染较小，且有很强的可行性（回收率达到87.7%）和很好的稳定性（RSD小于2.5%），很适合对大量肉制品同时进行前处理，能真正意义上实现肉制品中苯并芘残留量的快速检测。

2.4 回归方程、检出限、回收率、精密度

表3 不同检测方法结果对比Table3 Resultsweregiven by differentdeterminingmethod

配制浓度为 0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，100.0 ng/mL的3,4-苯并(α)芘标准使用溶液，依次进样，以所得峰面积为横坐标（X），标准使用液浓度为纵坐标（Y）绘制标准工作曲线标准。试验测得3,4-苯并(α)芘标准工作溶液在0.5～100 ng/mL浓度范围内，其线性回归方程为Y=4.095×10-5X-4.449×10-2，相关系数R=0.999 9，表明线性关系良好。

对空白样品进行测定，以3倍信噪比作为方法检出限，10倍信噪比作为方法定量限。肉制品中苯并芘的检出限为0.15μg/kg，定量限为0.50μg/kg。以3种浓度添加水平重复测定5次，分别计算各种浓度添加水平回收率及精密度，检验方法的稳定性和可行性，所得结果见表4。

表4 不同浓度添加水平回收率及精密度Table4 Recovery and precision atdifferentddition levels

由表4可知，3种浓度添加水平的回收率都大于87%，保证了本试验检测方法的可行性；而精密度均小于2.4%则保证了结果的稳定性和准确性。

2.5 不同样品的检测

选取牛肉、猪肉、兔肉、鸡肉、羊肉、鱼肉、香肠、猪舌尖、猪脸，用本试验报道方法检测，每种样品取5个平行，所得结果见表5。

表5 不同样品检测结果Table5 Determining resultsofdifferentsample

试验结果表明，将本方法应用到不同肉制品中苯并芘进行前处理时，平行性非常好（RSD均小于2.5%），表明此方法稳定可靠，完全可以作为肉制品中苯并芘残留量检测的前处理方法。

3 结论

本试验通过乙酸乙酯超声提取、旋蒸浓缩、甲醇反提净化对肉制品进行前处理，进而结合高效液相色谱仪—荧光检测器测定肉制品中3,4-苯并(α)芘残留量，结果表明：3种浓度添加水平样品（5，50，500 ng）经乙酸乙酯超声提取两次、旋蒸浓缩、甲醇反提净化后，回收率分别为87.4%，88.1%，87.6%，精确度分别为2.37%，2.06%，1.83%，方法检出限为0.15μg/kg。本方法可行性大，稳定性和准确性好，与文献[6]、[15]的方法相比具有更稳定、更准确，操作简单、低污染、低成本等优势，符合环境友好型检测要求，适合肉制品中3,4-苯并(α)芘残留量检测。

1 刘治娟，姬艳丽，吴源，等.苯并(α)芘引起鼠胸腺细胞DNA损伤及其机制[J].毒理学杂志，2005，19(4)：284～286.

2 Li D，Firozi P F，Wang L E，et al.Sensitivity to DNA damage induced by benzo(α)pyrene diol epoxide and risk of lung cancer[J].Cancer Res，2001，61(4)：1 445～1 450.

3 Garry S，Nesslany F，Aliouat E，et al.Assessment of genotoxic effect of benzo(α)pyrene in endotracheally treated rat using the comet assay[J].Mutation Res，2003，534(1-2)：33～43.

4 王家锦，穆莹，宋桂宁，等.苯并芘致癌致畸作用的观察与研究[J].中国优生优育，1997，8(4)：159～161.

5 赵勤，王卫.熏熏烤肉制品卫生安全性及其绿色产品开发的技术关键[J].成都大学学报（自然科学版），2005，24(2)：107～110.

6 胡奇杰，沈黎炜，戚民，等.高效液相色谱法测定肉制品中的苯并芘[J].食品研究与开发，2010，31(6)：146～149.

7 S Vazquez Troche，M S Garc’a Falcón，S González Amigo，et al.Enrichment of benzo[a]pyrene in vegetable oils and determination by HPLC-FL[J].Talanta，2000，51(6)：1 069～1 076.

8 Pena T，Pensado L，Casais C，et al.Optimization of amicrowave～assisted extraction method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons from fish samples[J].Journal of Chromatography，2006，1 121(2)：163～169.

9 何强，孔祥虹，李建华，等.采用新型固相萃取柱快速测定食用植物油中苯并[a]芘[J].分析测试学报，2012，31(6)：710～714.

10 Maria Joаo Ramalhosa,Paula Paíga,Simone Morais,et al.Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in fish:evaluation of a quick,easy,cheap,effective,rugged,and safe extraction method[J].Journal of Separation Science，2009，32(20)：3 529～3 538.

11 Jalal Hassan，Abolfazl Farahani.GC—MS determination of PAHs in fish samples following salting-out-assisted solvent extractiongel permeation chromatography[J].Chromatographia，2011，74(5-6)：477～482.

12 章汝平，郭萍，李锦辉.气相色谱—质谱法测定肉松、鱼干中的多环芳烃[J].食品科技，2008(6)：213～217.

13 汤桦，陈大舟，吴雪，等.同位素稀释高分辨质谱法测定鱼组织中 6 种多环芳烃[J].质谱学报，2010，31(4)：208～213.

14 弓玉红，郝林，郭凯凯.萃取—紫外分光光度法测定土壤中3,4-苯并芘含量[J].山西农业科学，2012，40(4)：383～385.

15 全国畜牧业标准化技术委员会.NY/T 1666——2008肉制品中苯并(α)芘的测定高效液相色谱法[S].北京：中国农业出版社，2008.