车前子超微速溶饮片中京尼平苷酸与毛蕊花糖苷的含量测定

邱倬星 熊学敏 胡晓艳 熊犇 陈乐 谢玲

[摘要] 目的 建立一种同步测定车前子超微速溶饮片中京尼平苷酸与毛蕊花糖苷含量的高效液相色谱方法。方法 采用液相色谱法，色谱柱为Hypersil ODS2 C18柱（4.6 mm×250 mm， 5μm）， 流速：1.0 mL/min， 检测波长： 254 nm， 柱温： 30℃。 结果 京尼平苷酸与毛蕊花糖苷的线性范围分别为0.191～1.910μg （r2= 0.999 8）和0.2002～2.002μg（r2=0.999 9）；平均加样回收率分别为100.1%（RSD=0.57%，n=6）和99.8%（RSD=0.28%，n=6）。结论 本方法操作简便，测定结果准确，重复性好，可作为该产品质控的方法。

[关键词] 京尼平苷酸；毛蕊花糖苷；高效液相色谱法

[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）05-41-03

車前子为车前科（Plantaginaceae）植物车前（Plantago asciatica L.）或平车前（Plantago depressa Willd.）的干燥成熟种子[1]，具有清热利尿、渗湿通淋、明目祛痰的功效还具有调节血脂和保护高脂血症大鼠血管内皮细胞损伤的功能[2]。目前关于车前子中含量测定的报道多集中于多糖，车前子苷及桃叶珊瑚苷[3-4]，而京尼平苷酸与毛蕊花糖苷的含量的文献报道甚少[5]。本实验在对车前子粉末研究的基础上，采用HPLC法，建立同步测定车前子超微速溶饮片中的京尼平苷酸与毛蕊花糖苷含量的研究，通过试验证明，由于药材的超微分化作用，其含量比对应的车前子药材含量要高。

本研究在制备单味中药超微速溶饮片工艺中，首次将超微粉碎技术、微波灭菌技术、真空包装等新技术同步运用到中药饮片的研究及加工领域，将中药饮片加工成微米级的颗粒饮片，使中药饮片从内在质量到外观包装都有了新的提高。单味中药超微速溶饮片，既保留了传统饮片的特色与优势，又避免了煎煮的麻烦，且节省药材、方便服用，是中药饮片领域的一项创新性工作，这一研制成果对保护药材资源，促进中药现代化、产业化具有十分重要的意义。

1 仪器与试药

岛津LC-20AD高效液相色谱仪（LC-solution工作站，LC-20AD二元泵，SPD-20A紫外检测器，10μL定量环），SimplicityTM型超纯水系统（Millipore公司）；Mettller Tkledo AG135双量程电子天平（1/10万）；京尼平苷酸对照品（供含量测定用，批号：111828-201102，中国药品生物制品检定所供）；毛蕊花糖苷对照品（供含量测定用，批号：111530-200706，中国药品生物制品检定所供）；车前子超微速溶饮片（由江西天聚堂中药饮片有限公司提供，粒度小于50μm，批号：（A1201040815、A1202021533、A1202101891），试验用甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2 C18，250 mm×4.6 mm，5μm（大连依利特公司）；检测波长为254 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；进样体积为10μL；流动相A为乙腈：甲醇（10：15），流动相B为0.5%醋酸水溶液（A+B=100%），流动相超声脱气，梯度洗脱。见表1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取京尼平苷酸对照品和毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，置同一100 mL的棕色定量瓶中（定量瓶预先校正），加60%甲醇溶解并定量稀释制成含京尼平苷酸0.095 5 mg/mL和毛蕊花糖苷0.100 1 mg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取车前子超微速溶饮片约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，称定重量，加热回流2 h，放置室温，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

分别精密吸取混和对照品液（按“2.2.1”项下制备）及供试品溶液（按“2.2.2”项下制备）各10μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件，记录色谱图（结果见图1、图2）。结果表明，在此色谱条件下，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷的保留时间分别约为5.00 min和25.00 min，分离度良好。理论板数按京尼平苷酸峰计算应不低于3000，按毛蕊花糖苷峰计算应不低于4000。

2.4 线性关系

分别精密称取京尼平苷酸对照品9.55 mg与毛蕊花糖苷对照品10.01 mg，分别置25 mL棕色量瓶中，加60%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得.分别精密吸取上述2种对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置2 mL容量瓶中，加60%甲醇稀释至刻度， 摇匀，作为系列对照品溶液。分别精密吸取上述6份对照品溶液各10μL，按选定色谱条件进样测定。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，京尼平苷酸的回归方程为Y=13.767X-3103.2，r2=0.999 8；毛蕊花糖苷的回归方程为Y=8.5137X-777.60，r2=0.999 9；结果表明京尼平苷酸在0.191～1.910μg之间线性范围良好，毛蕊花糖苷在0.2002～2.002μg之间线性范围良好。

2.5 精密度试验

精密吸取同一对照品溶液，按“2.1”项下的方法连续进样6次，分别测定京尼平苷酸，毛蕊花糖苷的峰面积，结果RSD分别为1.84%、2.01%（n=6），表明精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批车前子超微速溶饮片（批号：A1202021533）按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，精密量取10μL，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算。结果京尼平苷酸，毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为1.00%，1.09%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取车前子超微粉末（批号：A1202021533），按“2.2.2”项下平行制备6份供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8h进样测定，记录京尼平苷酸与毛蕊花糖苷的峰面积，RSD分别为1.00%，1.09%（n=6），结果表明，8h内供试品溶液中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷基本稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的车前子超微速溶饮片（A1202021533），分别定量加入京尼平苷酸对照品与毛蕊花糖苷对照品，按“2.2.2”项下制备供试溶液。精密进样10μL。按“2.1”色谱条件测定，计算京尼平苷酸平均回收率为100.1%，RSD值为0.57%；毛蕊花糖苷平均回收率为99.8%，RSD值为0.28%。见表2。

2.9 样品含量测定

取3批车前子超微速溶饮片约1 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依次进样记录峰面积。对照品溶液按“2.2.1”项下方法制备，用外标法计算2种成分的含量。3批样品含量见表3。

3 讨论

本实验如采用2010版药典一部对应车前子药材项下含量测定[4]的流动相进行梯度洗脱，峰形不好，保留时间长，基线漂移现象严重；后分别改用乙腈：甲醇：1%醋酸（10∶15∶75）；乙腈：甲醇：0.1%醋酸（10∶15∶75）；乙腈：甲醇：0.5%磷酸（10∶15∶75）；[流动相A为乙腈，流动相B为水：磷酸（86∶0.1）梯度洗脱]等4种系统作为流动相，前3种系统分离效果均不好，京尼平苷酸出峰时间短，峰形不好；第4种系统的出峰时间比本实验选择的流动相出峰时间要长，且京尼平苷酸的分离效果相对要差一点，经多次试验并调整流动相，最后确定流动相A为乙腈：甲醇（10∶15），流动相B为0.5%醋酸水溶液（A+B=100%）此体系进行梯度洗脱，京尼平苷酸和毛蕊花糖苷与相邻峰得到较好的分离，峰形也较好。

车前子药材加工成超微速溶饮片后，在相同的提取条件下进行含量测定，超微速溶饮片中的各成分含量较药材中提高，3组车前子超微速溶饮片中京尼平苷酸与毛蕊花糖苷的平均含量分别是0.761%，1.160%；3组车前子药材中京尼平苷酸与毛蕊花糖苷的平均含量分别是0.742%，1.129%；这说明经加工后的超微速溶饮片中有效成分的溶出率有提高。

目前，超微粉碎可供选择的设备有很多，常用的超微粉碎设备有机械冲击式粉碎机，气流粉碎机，球磨机，振动机，搅拌磨等各种类型[6]。中药材经超微粉碎，可使粉体比表面积和孔隙率增加而具有独特的物理化学性能，易于在体内吸收利用[7]。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京：化学工业出版社，2000：51.

[2]何永婷，朱贺年.车前子的研究进展[J].北方药学，2011，8（1）：55-57.

[3] 高明哲，袁呂鲁，徐青，等.高效液相色谱法测定大车前子中车前子苷的含量[J].现代中药研究与实践，2004，18（增刊）：34-36.

[4] 吴祥松，刘贤旺，黄慧莲，等.江西道地药材车前子中桃叶珊瑚苷含量的测定[J].中药科技，2002，4 （11）：18-20.

[5]国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010：63.

[6] 王艳艳，王团结，丁琳琳.中药超微粉碎技术与装置研究[J].装备应用与研究，2011，23（8）：35-40.

[7] 蔡光先，杨永华.中药超微饮片质量标准的规范化研究[M].湖南科技出版社，2007：1-5.

（收稿日期：2013-01-29）