有关基因工程题的解析

孔年红

21世纪是基因工程技术蓬勃发展的时代，基因工程的兴起是生物革命的必然结果，尽管基因工程的隐忧及争论众说纷纭，但其给人带来的好处是显而易见的。于是，作为热点题，近几年的高考题及一些模拟试卷中都有此类题型出现，且越考越细，难度也有所加大。下面笔者举两例谈谈此类题目的解析。

（1）①和②过程中所用的限制性内切酶分别是______、______。

（2）基因表达载体除了图示组成外，至少还有______等（至少答两个）。

（3）③过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体。用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正义基因表达载体获得0.05kb、3.25kb、5.95kb、9.45kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是______和______。

（4）④过程中利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是______，转化后的细胞再通过______形成植物体。

（5）导入细胞内的反义GhMnaA2 转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达，其意义是______。

【解析】这道题考查了基因工程的步骤、意义以及涉及的其它生物技术，比较具体。基因表达载体的构建是基因工程的核心，因此是本题的重点考查内容。构建目的基因的表达载体必须使目的基因和载体被限制性核酸内切酶同时酶切后露出相同的粘性末端。

（1）从图中可以看出，纤维细胞E6启动子两侧分别是限制酶HindⅢ和BamHⅠ的识别位点，所以①过程所用的限制性内切酶就是HindⅢ、BamHⅠ。同样，目的基因GhMnaA2 两侧都是限制酶SmaⅠ的识别位点，所以②过程中所用的限制性内切酶就是SmaⅠ。

（2）基因表达载体的组成有复制原点、目的基因、启动子、终止子和标记基因。

（3）如下图，把用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正义基因表达载体获得DNA片段长度标在左图上，同样在右图上也可以标上相应的DNA片段长度，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是6.0kb和12.7kb。

（4）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。所以④过程中利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是（含有E6启动子和GhMnaA2基因的）T-DNA。而转化后的细胞形成植物体就是植物组织培养。

（5）导入细胞内的反义GhMnaA2 转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2 转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达，就不能产生的β-甘露糖苷酶，就不能催化半纤维素降解，棉纤维长度也就不会变短。

请据图回答下列有关问题：

（1）设计引物是cDNA（互补DNA）文库构建过程的第一步，引物长度一般在15-30个碱基之间，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。若引物过短则存在______等问题。

（2）图甲过程②、③分别需要在____、____酶的作用下形成cDNA 的第一条链、第二条链，这两个过程都需要利用_____作为原料。

（3）在⑤和⑦过程中cDNA和质粒DNA的3'端都要各加上一段寡聚核苷酸（20个以下碱基的核苷酸短链），制成_____；过程⑧在DNA连接酶的作用下，形成重组DNA。图示这种情况下能形成_____种重组DNA，理由是______。

（4）请根据图乙电泳图谱分析各限制酶的酶切位点，并在答题纸的质粒上标出各个限制酶的酶切位点和各位点间的大小。

【解析】这道题考查了构建基因文库的过程及相关知识。

（1）设计引物是cDNA（互补DNA）文库构建过程的第一步，引物长度一般在15-30个碱基之间，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。若引物过短会降低退火温度影响引物与碱基配对，从而使非特异性增高。

（2）以mRNA为模板合成cDNA需要逆转录酶，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶作用合成双链cDNA。合成cDNA需要的原料为4种游离的脱氧核苷酸。

（3）在⑤和⑦过程中cDNA和质粒DNA的3'端都要各加上一段寡聚核苷酸（20个以下碱基的核苷酸短链），制成黏性末端。同一种DNA的两端的黏性末端是相同的，不存在自身环化或同种DNA两两结合的现象，所以只有目的基因正反两种连接方式。

（4）根据图乙电泳图谱分析各限制酶的酶切位点判断EcoRI的酶切位点在PstI和SalI之间。再画图，注意碱基对的多少比例。

答案：（1）没有一定的特异性，容易导致错配（或影响退火温度）；（2）逆转录酶；DNA聚合酶；游离的脱氧核苷酸（3）黏性末端；1（或2）；同一种DNA的两端的尾巴是相同的，不存在自身环化或同种DNA两两结合的现象。（4）如下图（2分）。

此类题的解答主要是依据基因工程的操作步骤中每一步的知识点，抓住题目文字和图示，必要时自己动手画画，多见识多练习，功到自然成。

（作者单位：江苏省黄桥中学）