Mn2+驱动的不同长度DNA片段PCR

廖红东 陆剑等

摘要：针对倾向错误的PCR技术中不同目的、不同长度基因的诱变种类一直缺乏准确参考的问题，以酵母spt15基因为研究对象，在标准的PCR反应体系中加入不同Mn2+摩尔浓度（0.125，0.250 和0.500 mmol·L-1）进行倾向错误的PCR，扩增spt15不同长度（分别约为200， 500和700 bp）的DNA片段，研究其突变频率，突变碱基数目及突变类型，以分析不同种类的突变所需的最佳条件.研究结果表明：长片段DNA的PCR突变率对Mn2+摩尔浓度更敏感；模板的长度对DNA PCR突变碱基个数也有较为明显的影响，低Mn2+摩尔浓度有利于单突变；Mn2+驱动的突变有明显的倾向性，其中A→G和T→C的突变居多.

关键词：突变； 倾向错误PCR； 锰离子；DNA片段

中图分类号：Q781 文献标识码：A

蛋白质的结构改造是当前蛋白质领域研究的热点之一.由于蛋白质分子结构的复杂性，蛋白质结构与功能的关系尚不完全明确.因此，在蛋白质的基因中加入随机突变，然后筛选出性质优良的突变株，是目前比较可行的方法[1].

目前基因引入随机突变的方法很多，主要有：自然传代突变、物理化学诱变、DNA重排和倾向错误的PCR等.利用易致突变菌株进行传代突变[2]，其突变率高于野生型细菌，但所需时间较长；化学致突变剂或物理辐射方法诱变虽然能引入突变[3]，但是突变方向往往不确定，无效突变体比例大，难有较好的筛选标记，效率较低；DNA重排（DNA shuffling）[4]，通过序列的随机片段化，PCR延伸再重组引起成功突变，但其操作较为复杂；倾向错误的PCR[1，5]，通过调整PCR的反应条件，增加碱基错配率，即可在100～1 000 bp片段中随机引入突变，是最便捷的方法之一.另外，倾向错误的PCR可以直接对核酸群体进行重复随机突变，使每一次获得的小突变积累而发生重要的突变，从而有利于蛋白质结构改造与功能研究.

湖南大学学报（自然科学版）2013年

第6期廖红东等：Mn2+驱动的不同长度DNA片段PCR随机突变研究

应用倾向错误PCR增加突变率的方法包括加入锰离子降低聚合酶对模板的特异性；增加镁离子的摩尔浓度稳定非互补碱基对；使用dITP替代某种dNTP，造成取代突变；增加dCTP和dTTP的摩尔浓度，来提高错误掺入率[1，6]， 等等.其中，在标准的PCR反应体系中加入适当摩尔浓度的锰离子，这种方法操作简单，产生的突变种类很多.但目前只有针对100 bp左右DNA片段的随机突变作了研究[7]，其他长度DNA的随机突变条件尚未见报道.因此，我们采用了3种锰离子摩尔浓度，分别对223，521和723 bp长度的DNA片段进行倾向错误PCR，可以为该随机突变方法的应用提供较为系统和准确的参考数据.

1材料和方法

1.1材料与试剂

野生型酵母BY4741由瑞士弗里堡大学Rogher Schneiter教授提供；大肠杆菌DH5α由湖南大学生物院分子生物学实验室提供；PYES2质粒购自美国invitrogen生命技术公司.

LA Taq为日本TaKaRa公司产品，T4 DNA连接酶为加拿大MBI公司产品，限制性内切酶为美国NEB公司产品.普通质粒小提试剂盒、超薄DNA产物纯化试剂盒和超薄琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；氨苄青霉素（Amp）购自美国Sigma公司；其他常用试剂均为国产分析纯.

3个不同长度的PCR反应引物共4个，见表1.测序所用正向引物序列为5 CGTCAAGGAGAA AAAACCC 3，反向引物序列为5GGGGAGGGCGTAATGTAAG 3，所有引物均由上海生物工程有限公司合成，测序由南京金思特科技有限公司完成.

注：“F”表示正向引物，“R”表示反向引物，括号内“S”表示被SacⅠ酶切，括号内“K”表示被KpnⅠ酶切，引物序列中的下划线表示限制性内切酶的识别序列.

1.2实验方法

1.2.1目的基因的准备

提取酵母总DNA，选取引物wtF1 和wtR1 扩增目的基因spt15（723 bp）.100 μL PCR723 bp体系中含有：模板50 ng，引物各20 pmol，dNTP各0.2 mmol/L，10 μL 10×PCR缓冲液，LA Taq酶5U.PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，27个循环，72 ℃延伸10 min.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，使用限制性内切酶KpnⅠ和SacⅠ消化，再次纯化后经T4 DNA连接酶与相同限制性内切酶消化的PYES2载体质粒连接，转入大肠杆菌DH5α.在含有氨苄青霉素的培养皿中挑选适当克隆测序，确认序列后将克隆扩大培养，提取重组质粒PYES2spt15，备用.

1.2.2常规PCR

以上述制备的重组质粒PYES2spt15为模板，分别选取3对引物进行223，521和723 bp DNA片段的PCR反应.反应体系同100 μL PCR723 bp体系.反应条件除PCR 223 bp 72 ℃延伸1 min，PCR521 bp 72 ℃延伸1.5 min之外，其他均与PCR723 bp的反应条件相同.

1.2.3倾向错误PCR

反应体系及条件同第1.2.2节，仅分别使用3种Mn2+摩尔浓度（0.125，0.250，0.500 mmol/L），Mn2+单独配制，不提前与PCR缓冲液混合，防止引起沉淀干扰PCR扩增.

2结果与讨论

2.1常规PCR的突变率

随机挑选3个常规PCR的产物测序，没有发现突变位点，可见以此系统为基础进行易错PCR是可行的.

2.2Mn2+摩尔浓度对不同片段长度DNA PCR

突变率的影响

针对不同长度DNA片段使用了3种Mn2+摩尔浓度（0.125，0.250，0.500 mmol/L）进行倾向错误PCR，测序后结果如图1所示.当Mn2+摩尔浓度相同时，随着DNA片段长度的增加，突变率明显上升.相同长度DNA片段，随着Mn2+摩尔浓度的增加，突变率也增加.这证明在PCR体系中加入Mn2+能够降低DNA合成过程中酶的保真性.其中，723 bp长度的DNA随着Mn2+摩尔浓度的提高，突变率迅速上升，而短片断223 bp的DNA对Mn2+摩尔浓度不特别敏感，虽然突变率也有上升，但是仅为长DNA（723 bp）突变率的1/5左右.521 bpDNA对Mn2+摩尔浓度的敏感程度介于两者之间.可见，长片段DNA PCR的突变率对Mn2+摩尔浓度更敏感.在蛋白质基因中，只要有0.11 %的碱基突变就能改变其表型，其他大多数突变是有害的[8]，而且过多的碱基突变还增加了筛选的负担.因此，在选择随机突变PCR的模板时，应使用cDNA或仅含有目的序列的双链DNA片段，不宜使用质粒DNA以及基因组DNA，使其长度限制在约1 000 bp以内.对于较长靶DNA的突变，可将其分为若干片段分别进行[9].

2.3Mn2+摩尔浓度对不同片段长度DNA PCR突

变碱基个数的影响

对酶的结构和功能的研究而言，每个基因中1～2个核苷改变（一个氨基酸变化）是较为理想的，即便是在酶的定向进化研究中，每个基因中2～7个核苷改变可能更好[10].因此 ，利用易错PCR技术对酶进行定向进化时，选择合适的突变碱基个数是定向进化技术的关键.

不同Mn2+摩尔浓度下，不同片段长度DNA易错PCR突变碱基个数结果如表2所示.由表2可以看出，当模板长度为223 bp时，易错PCR的碱基突变以单一碱基突变为主（为50%）；当模板长度为521 bp时，单一碱基突变随着Mn2+摩尔浓度增加而不断下降，至Mn2+摩尔浓度为0.500 mmol时，五碱基突变达到50%；当模板长度为723 bp时，低Mn2+摩尔浓度即出现明显的三突变（为25%），当Mn2+摩尔浓度增加至0.500 mmol时，突变均为五碱基突变和六碱基突变（分别占25%和75%）.因此，要取得较多单突变或者更有效的突变体，对DNA片段，尤其是长片段应采用低Mn2+摩尔浓度.

2.4Mn2+对不同片段长度DNA突变类型的影响

我们的实验结果没有发现突变热点，基本都是点突变，随机分布于DNA序列中，插入和缺失率为0.023%，符合Cadwell等[11]的报道.Leung等[12]报道随机突变PCR产生相同数量的转换和颠换突变，而我们的实验显示（表3），Mn2+造成突变类型有明显的倾向性，在75个突变中，A→G和T→C的突变最多，这两者占了突变总数的54.67%.转换（76%）是颠换（24%）的3倍多，发生于A/T的突变占了73.34%，而G/C突变只有26.66%.与其他一些报道相似[8，11].使用Mn2+造成突变类型有明显的倾向性，可以考虑加入dITP并减少某些dNTP或者调整4种dNTP的量改变突变类型.

3结论

DNA随机突变技术是蛋白质体外分子进化研究的基础，研究PCR随机突变频率和变化规律是提高构建DNA随机突变体库质量和效率的关键.在标准PCR反应体系中加入Mn2+可以有效地降低Taq DNA聚合酶的保真性，造成碱基的突变.Mn2+离子驱动的不同长度DNA片段PCR随机突变的研究表明：

1）PCR突变率对Mn2+摩尔浓度敏感程度与模板的长度关系密切，长片段DNA的PCR突变率对Mn2+摩尔浓度更敏感.

2）模板的长度对DNA PCR突变碱基个数也有较为明显的影响，欲使随机突变体库有更多单突变或者更有效的突变体，采用低Mn2+摩尔浓度为好.

3）Mn2+驱动的突变基本都是点突变，随机分布于DNA序列中造成突变类型有明显的倾向性，其中A→G和T→C的突变居多.

参考文献

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[6]BLAGODATSKI A. VLADIMIR L K.Technologies of directed protein evolution in vivo[J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2011， 68（7）：1207-1214.

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[12]LEUNG D W， CHEN E， GOEDDEL D V. A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction[J]. Technique， 1989， 1： 11-15.