快速PCR介导的NeuroD—3′UTR的定点突变研究

赵金艳+卢宏+张振武+梁洋

摘要：糖尿病是一种由遗传和环境因素共同引起的代谢紊乱综合征。与肝细胞核因子有关的幼年发病的成人型糖尿病（MODY） 属于特殊类型的糖尿病，分为6型，其中Ⅵ 型MODY 为bHLH 家族转录因子NeuroD 突变引起的疾病。在体内NeuroD能够与A类bHLH的转录因子E47结合，进而形成二聚体。这种二聚体能够与胰岛素基因的E盒高亲和力结合，从而激活胰岛素相关基因的转录表达；因此，NeuroD对胰腺β细胞的生理功能有很重要的影响。本试验利用PGMT-NeuroD-3′UTR质粒，通过一次PCR方法使NeuroD-3′UTR上的多个位点发生定点突变，并筛选出突变的目的片段；随后将突变的片断连接到萤光素酶报告载体PGL3-CONTROL上，构建了PGL3-3′NeuroD突变载体。该结果可为探讨NeuroD基因在胰腺β细胞发育中的生理功能，及进一步治疗糖尿病的研究提供了试验基础。

关键词：NeuroD；PCR；突变；载体构建；糖尿病

中图分类号： Q754

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0087-03

糖尿病（diabetes mellitus）是一种代谢性疾病，其特征为由于胰岛素分泌不足、胰岛素功能障碍或两者同时存在而导致的，以慢性高血糖并伴有碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱[1]。糖尿病是一种由多种因素导致的疾病，这些因素包括遗传因素、自身因素（自身免疫）及环境因素[2]等。

神经分化因子1 （NeuroD-1） 是一种bHL H蛋白[3] 。在生物学中，NeuroD-1又称为β细胞E盒转录激活因子2 （Beta-2） 。NeuroD-1/Beta-2对靶基因的转录激活/抑制作用主要通过和靶基因中的特异性序列结合来实现的。同时，NeuroD-1/Beta-2也能够与其他靶基因的转录因子发生作用，协同调节靶基因的活性状态，进而影响相关基因的生理功能。随着生物学的不断发展，相关研究表明NeuroD-1/Beta-2基因发生突变时，对糖尿病的发生有一定的影响[4]。在利用模式生物小鼠研究NeuroD-1/Beta-2的生物学功能时发现，当NeuroD-1/Beta-2 基因缺失时，小鼠发生严重的糖尿病，并且这些患有严重糖尿病的小鼠在围产期发生死亡。在NeuroD-1/Beta-2基因纯合缺失的小鼠中表现的酮尿证实，这种严重的糖尿病是由于β细胞功能发生异常导致的[5]。因此，NeuroD-1/Beta-2 基因对研究胰腺发育和糖尿病机制具有重要的意义。

基因突变技术常用于研究基因调控、表达和蛋白质的结构功能等，其中，定点突变技术已经越来越被生物学家广泛应用于基因工程、蛋白质工程研究。目前使用较广泛的主要有重组PCR法、重叠延伸法、U模版法和大引物突变法等。其中，重叠延伸的方法和大引物突变的方法均需要多次PCR和多对引物，才能使得目标突变率高，这种方法操作复杂并且步骤繁琐。快速PCR介导的定点突变方法仅需1次PCR 反应，目标突变效率高，操作简单，节约成本[6]。

本试验为了构建NeuroD-3′UTR的定点突变，进一步研究NeuroD基因与糖尿病之间的生物学机制，采用快速PCR定点突变的方法，对NeuroD-3′UTR同时进行多个位点的突变，并筛选出突变的目的片段，构建了PGL3-3′NeuroD 突变载体，为探讨NeuroD基因在胰腺β细胞发育中的生理功能，及进一步治疗糖尿病的研究提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PGMT-NeuroD和PGL3-CONTROL载体由笔者所在实验室保存。

JM109感受态细胞，D2000 Plus DNA ladder购自北京索莱宝科技有限公司；1 kb DNA Ladder Marker购自于北京艾德莱生物技术有限公司；限制性内切酶XbaⅠ与FseⅠ（NEB公司），T4 DNA连接酶（TaKaRa公司）；DNA凝胶回收试剂盒、快速质粒小量提取试剂盒均购自Omega公司；琼脂糖购自Biowest公司，其余试剂为国产分析纯试剂；PCR引物、质粒测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 突变引物设计与合成 根据NeuroD的编码序列（GenBank序列号：gi：226493587）（粗体为突变位点）设计上游引物P1，序列为：5′-GAAAAAAAACCAACAAATTCGTCAATTTGAGCAATTCATCT-3′，下游引物P2，序列为：5′-AGATGAATTGCTCAAATTGACGAATTTGTTGGTTTTTTTTC-3′。

1.2.2 快速PCR介导的突变 以PGMT-NeuroD-3′UTR为模板，采用PCR方法使NeuroD-3′UTR发生多个位点的定点突变。PCR反应体系为20 μL，反应条件为：94 ℃初始变性5 min，16个循环（ 94 ℃ 1 min，58 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min），72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存。扩增片段大小应为 3 432 bp，纯化PCR扩增的产物。

1.2.3 NerouD-3′UTR突变质粒构建及鉴定 回收产物用DPN1酶消化模版，消化时间为8 h。消化反应体系为：PGMT-NerouD-3′UTR（PCR回收）17.5 μL，10×DNP1 buffer 2 μL，DNP 1 （10 U/μL）1 μL。将消化产物转化进JM109大肠杆菌感受态细胞，筛选得到阳性克隆，经菌液PCR验证后提取质粒，所提质粒经PCR验证后用XbaⅠ与FseⅠ酶进行双酶切检测，用琼脂糖凝胶验证突变片段正确后，将获取的目的DNA 送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定。

1.2.4 PGL3-3′UTR载体的构建与鉴定 用XbaⅠ与FseⅠ酶分别对Pgmt-NeuroD-3′UTR和 PGL3-CONTROL进行双酶切处理，1% 琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收相应目的DNA和质粒酶切片段。DNA片段与酶切的PGL3-CONTROL载体采用T4 DNA 连接酶16 ℃ 过夜连接，转化后经菌液PCR验证所提质粒，XbaⅠ与FseⅠ双酶切鉴定后，将重组质粒命名为PGL3/NeuroD-3′UTR载体。

2 结果与分析

2.1 PCR介导的PGMT-NeuroD-3′UTR突变

设计突变引物P1/P2，以实验室自存PGMT-NeuroD为模板，采用一次快速PCR方法将PGMT-NeuroD-3′UTR上多个碱基突变。将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定结果显示，扩增产物约为3 432 bp左右的DNA条带且特异性较高，同预期片段的大小符合（图1）。

2.2 PCR介导的PGMT-NeuroD-3′UTR突变检测

将突变产物经DPN1消化后转入大肠杆菌感受态细胞JM109中，挑取克隆，通过菌液PCR检验克隆的准确性，将菌液PCR鉴定正确的菌液用质粒提取试剂盒提取突变质粒，利用引物P1/P2对所提取的质粒进行PCR检测，PCR产物约为417 bp，通过1%琼脂糖凝胶电泳检验，条带大小符合预计（图2）。

同时利用XbaⅠ与FseⅠ对所提质粒进行双酶切检测，经1%琼脂糖凝胶电泳，短片段约417 bp，长片段3 000 bp左右，符合预计大小（图3）。

将突变完成的质粒送到公司测序，测序结果显示正确，目标位置成功突变，位于1854、1855、1856位置的碱基由TTGCACA变成TTCGTAC，并且没有出现其他碱基的突变（图4）。

2.3 PGL3-NeuroD3′UTR突变载体的构建

将表达载体PGL3-CONTROL与突变完成的质粒用XbaⅠ与FseⅠ双酶切，并胶回收，1%琼脂糖凝胶电泳检验酶切胶回收结果，条带大小符合预计（图5）。连接转化后挑取4 个单克隆菌落培养过夜，通过菌液PCR检验克隆的准确性，引物为P1/P2，全长为417 bp，通过1%琼脂糖凝胶电泳检验，有2个克隆的条带大小符合预计（图6）。

将菌液PCR鉴定正确的菌液用质粒提取试剂盒提取质粒，利用提取的质粒，通过扩增引物P1/P2，做质粒PCR，条带位于400～500 bp之间（图7），符合预计大小。同时利用XbaⅠ与FseⅠ双酶切检测所提取的质粒，条带符合预计大小（图8），显示PGL3-NeuroD-3′UTR突变载体构建成功。

3 讨论

糖尿病（diabetes mellitus）是一组由于胰岛素分泌不足、胰岛素功能障碍或两者同时存在而导致的代谢性疾病。其特征为慢性高血糖并伴有碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱。糖尿病是一种由多种因素导致的疾病，这些因素包括遗传因素、自身因素（自身免疫）及环境因素。NeuroD-1/Beta-2对靶基因的转录激活/抑制作用主要通过和靶基因中的特异性序列结合来实现的。同时，NeuroD-1/Beta-2也能够与其他靶基因的转录因子发生作用，协同调节靶基因的活性状态，进而影响相关基因的生理功能，调节靶基因的最终活性状态[7]。前期研究表明NeuroD-1/Beta-2基因发生突变时，对糖尿病的发生有一定的影响，且Beta-2作为一种转录因子能够激活磺脲类受体基因1（SUR-1） [8]。在生物体中，β细胞胰岛素的分泌情况受SUR-1的调节，这种调节机理主要是NeuroD-1 能够和SUR-1的E3元件结合，进而诱导相关的组织发生特异性表达。研究发现MEK-ERK 信号通路在葡萄糖刺激下能够影响NeuroD-1 的活性，NeuroD-1发生入核，促进了胰岛素相关基因的转录表达[9]。因此，NeuroD-1基因对研究和治疗糖尿病具有重要的意义。

基因突变技术应用很广泛，这种技术制备的突变体可用于研究基因的调控表达情况、蛋白质的结构与功能[10]。随着定点突变技术的发展，蛋白质的结构与功能主要通过突变体研究来实现。寡聚核苷酸引物与靶DNA 杂合分子中间的单个碱基的错配并不影响扩增效率，因此利用引物区域的错配使PCR 产物定点突变的方法可以导致DNA的定点突变。近年来，产生了一种新型定点突变的PCR方法，该方法是把需要突变的基因克隆到质粒载体上，用2个突变引物同时扩增质粒DNA，用限制性内切酶对模板DNA进行消化，然后转入大肠杆菌并筛选阳性克隆。由于该方法仅需1次PCR 反应，很大程度地降低了反应时间，所以被称为快速PCR法，这种新的PCR方法减少了反应中因碱基错配而造成的非特异突变，提高了目标突变率。

本试验即根据上述原理，采用一次快速PCR定点突变方法，对NeuroD-3′UTR的多个位点进行定点突变，经PCR检测及测序鉴定，目标位置突变成功，1854、1855、1856位置的碱基由TTGCACA变成TTCGTAC（图4），测序结果显示，没有出现其他碱基的突变，降低了碱基错配的概率，提高了突变效率。随后将突变片段连接到萤光素酶报告载体PGL3-CONTROL上，经PCR和酶切鉴定，成功构建了PGL3-NeuroD-3′UTR突变载体（图7、图8），为后续NeuroD基因的研究，以及通过该基因为糖尿病的研究奠定了基础。

参考文献：

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