石蜡切片制作方法的改良

毛晓霞

摘 要：创立了一种时间短、质量高的石蜡切片制作方法。针对动植物材料结构特点不同，在脱水、透明、透蜡、包埋、染色和封固等环节进行了一系列改良，获得了染色清晰、组织结构完整的切片。该文以小蜡树为例，详细介绍了改良后的石蜡切片制作方法。实验结果表明，相比传统制作方法，改良后的制作方法减少了切片制作时间，缩短了实验周期。同时，有效地提高了批量制备石蜡切片标本的整体质量，有利于实验教学和组织学、病理学等领域的研究工作。

关键词：组织学；石蜡切片；制作方法：改良

中图分类号 Q-34 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）08-15-02

石蜡切片制作技术近年来广泛应用于组织学、细胞生物学、法医学和病理学等领域。细胞和组织多为无色透明，离开机体后会很快发生溶解和腐败，细胞原始形态和结构难以保存[1]。通过石蜡切片制作技术，经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色及封固等步骤，可以清晰辨认其形态结构，增加样品不同细胞成分之间的对比度。但缺点是石蜡切片制作过程复杂，制作周期长，组织块易破碎，切片皱褶多等[2]。笔者通过长期的摸索，改进了常规石蜡切片制作方法，缩短了时间，并将重点步骤加以改良，以利于短时间制作出高质量的切片。本文以小蜡树为例，将改良后的石蜡切片制作方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料 小蜡树叶片采自安庆师范学院植物园。试验仪器：石蜡切片机Leica RM2235、恒温培养箱、水浴锅、光学显微镜。试验试剂：无水乙醇、95%乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡为上海标本模型厂生产，熔点56～58℃，中性树胶为上海生工产品，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 取材与固定 摘取幼嫩的小蜡树叶片，拿双面刀片，过叶片主脉做横切面，切成1cm×1cm大小，取材后立即投入carnoy固定液中固定。4℃保存，固定7d，可以延长固定时间，但最长不超过两周[3]。取材要准确、迅速和新鲜，防止细胞组织发生自溶现象[4]。固定液的体积应为材料总体积的10～15倍。除了carnoy固定液外，根据实验材料性质不同，选取不同的固定液。例如动物使用20%福尔马林，原位杂交使用4%的多聚甲醛，也可将多种固定液混合使用。

1.2.2 脱水与透明 将固定后的材料用镊子夹出，投入不同浓度梯度的乙醇中脱水，乙醇要放在有盖容器中[5]。依次为：50%乙醇、6h—>75%乙醇、6h—>85%乙醇、3h—>95%乙醇、1h，95%乙醇、0.5h—>无水乙醇Ⅰ、10min—>无水乙醇Ⅱ、10min—>丙酮0.5h。

样品材料完成脱水后，还需用透明剂替代脱水剂，增加样品的折光率，该过程也需要在浓度梯度下进行以达到更好的透明效果。将样品放入有盖容器内，将无水乙醇与二甲苯等比例混合，透明0.5h，再放入二甲苯Ⅰ、5min，二甲苯Ⅱ、5min。时间不宜过长，以免使组织变硬发脆，切片时容易出现裂痕。

1.2.3 浸蜡与包埋 将样品放入融化的固体石蜡中慢慢浸透，2～4个h效果最好，时间过长会造成组织脆变[6]。浸蜡完成后，将油纸折叠成纸船，油面向内，保证内面的干净和平滑，将融化好的石蜡倒入纸船，石蜡触手温热，温度不能高于50℃。将组织材料放入，并用镊子摆好横切面位置，一个包埋块内根据材料大小放入5～7片样品。包埋时动作要迅速，防止石蜡块凝结。

1.2.4 切片、贴片 将包埋块放6℃冰箱中过夜，便于切片。将做好的包埋块底部用酒精灯加热，待底部石蜡融化后焊在小木块上。用酒精灯加热镊子，用镊子将包埋块和木块焊接牢固。修整包埋块，让样品露出，包埋块上下两边平行。调整切片机刀刃与蜡块表面成5°夹角，刀片从最左侧开始使用，以延长刀片使用寿命。必须使用锋利的刀片，否则蜡带易卷曲有波纹[7]。将切好的蜡带放入40℃蒸馏水中展片，在载玻片上滴一滴明胶粘片剂，手指涂匀，用载玻片捞出切片，调整蜡带，使其处于玻片的中心位置，也可用镊子将蜡带的皱褶展平。将贴好的切片于温箱中烤干，温度不超过60℃、0.5h，温度过高或者时间过长会造成切片产生气泡或者脱片。

1.2.5 染色 切片烤干后，经二甲苯脱蜡8min，逐级乙醇复水，每级5min，然后进行染色[8]。先用1%番红水溶液染色2h，再用1%固绿染色5min。染色时间根据环境温度和染料配置时间略作调整。环境温度低，染料不是新鲜配置的，可适当增加染色时间。若环境温度过低，可放入烘箱中加热。

1.2.6 脱水、透明、封片 染色完成后，浓度梯度乙醇每级脱水10min，最后一步无水乙醇脱水0.5h，再用二甲苯透明8min，用中性树胶封片。

2 结果与分析

制成的小蜡树石蜡切片在光学显微镜下观察，细胞结构完整，细胞核清晰可见，染色质均匀，细胞核和染色质色彩鲜艳，对比明显，切片厚度均匀，切片制作观察结果理想。在切片制作过程中，要注意两点：

2.1 材料的脱水要彻底 在脱水过程中，常见的问题是脱水不彻底和硬化。若样品组织有残留水分，二甲苯和液体石蜡将无法渗入组织，给透明和浸蜡带来不便。脱水不彻底，会造成切片呈现云雾状，此时要重新进行脱水步骤。为使组织与支持剂混合，有利于组织的透明和浸蜡，必须把组织中的水分彻底脱除[9]。

首先，选择合适的乙醇浓度梯度，不能首先放在较高浓度的乙醇中，防止组织骤然失水，导致细胞结构变形。如果是含水分较多的物质，最好用40%的乙醇开始脱水，浓度梯度至少要包括5级，最后无水乙醇要重复2次。盛放样品的容器在装溶剂前也要晾干水分，以免降低试剂浓度。

其次，要选择合适的脱水时间。时间的长短根据实验材料的性质、大小和厚度等来确定。柔软或者轻薄的材料，比如小鼠脑组织，脱水时间不宜太长，否则造成组织过度硬化和变脆，切片时会碎裂。样品较厚、组织坚硬的材料适当延长脱水时间[10]。组织块在高浓度乙醇中，尤其是无水乙醇中，不能放置太长时间。无水乙醇有很强的吸水能力，组织块迅速大量失水，导致过度硬化，给切片带来困难。如果脱水的过程中需要过夜，可以将组织块停放在70%的酒精中保存。

第三，保证稳定的试剂浓度。不仅是脱水、固定、透明、脱蜡、复水、染色等步骤都需要准确的试剂浓度，而且在实验进行的过程中都要保持试剂浓度的稳定，以达到最好的实验结果。所以，需在有盖容器中进行，防止乙醇蒸发，也可以更换新液。更换试剂时，动作要迅速，避免试剂和样品组织吸收空气中的水分[11]。

最后，清除切片上试剂残留，减少试剂间的相互干扰。将组织块从低浓度溶液中拿出后，要放在吸水纸上吸干水分，防止把低浓度试剂带入高浓度试剂中，影响最终的切片质量。

2.2 注意石蜡的选择与制备 首先，根据组织的密度、切片厚度和气候选择不同种类的石蜡。天热的时候（30℃以上）或者细胞壁坚韧的组织用高熔点石蜡，天冷的时候（30℃以下）或者较软组织，用低熔点石蜡。或者先用低熔点石蜡浸透，再放入硬度高的高熔点石蜡中浸透[12]。浸蜡是用石蜡置换组织中的透明剂，为包埋提供固相支持。包埋进一步强化了组织的硬度，使组织和包埋剂处于同一硬度，便于切片和粘连。所以，浸蜡和包埋所选用的石蜡要一致，以保证切片时能够切出完整蜡片。

第二，石蜡的制备。良好的石蜡块应是半透明状态，洁净，不含有水分、杂质、结晶或者颗粒等其他异物，触手滑而不腻。新石蜡在使用之前，需要反复加热沸腾，用纱布过滤，除去气泡和杂质。如果石蜡过硬，可以融化后加入蜂蜡、松香等，以降低硬度，增加其柔韧性，便于切出平滑和完整的切片。旧石蜡制样效果好，尽量选用旧石蜡。也可以将新旧石蜡混合融化，新石蜡的量不超过1/3。

第三，在进行浸蜡和包埋前，样品组织表面沾有透明剂二甲苯，如果二甲苯挥发不完全，会造成组织块变软，组织表面凹陷。所以，要风干样品组织表面的二甲苯，防止二甲苯带入石蜡。石蜡在长时间的使用过程中会落入灰尘和杂质，因此需要多次融化过滤，保证石蜡质量。

最后，如果包埋后的蜡块有白色混浊状，可能是由于脱水不彻底、二甲苯挥发不完全、石蜡不纯、质地不均等造成，需要找出原因，重新制作[13]。一个好的包埋块应该是半透明、质地均匀和无颗粒的状态。

参考文献

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[13]韩宝，冯永庆，秦岭. 板栗雄花序石蜡切片改进方法的研究[J].安徽农学通报，2008，14（3）：29-30. （责编：陶学军）