紫薇基因组DNA的分离纯化

2013-04-29贾永平余占荣张红梅孙毅

天津农业科学 2013年9期

关键词：测定提取紫薇

贾永平余占荣张红梅孙毅

摘要：利用改良CTAB法提取了紫薇叶片细胞基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳紫外分光光度计进行测定。结果显示，提取的DNA没有明显的降解，并有较高的浓度，纯度一般。获得的DNA可进一步用于后续分子生物学试验。

关键词：紫薇；DNA；改良CTAB法；提取；测定

中图分类号：Q936 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.09.001

Isolation and Purification of the Genomic DNA from Lagerstroemia indica L.

JIA Yong-ping1， YU Zhan-rong2， ZHANG Hong-mei3，5， SUN Yi4，5

（1.Baode Seed Management Station of Shanxi Province，Baode，Shanxi 036600，China；2.Xinzhou Seed Control Station of Shanxi Province，Xinzhou，Shanxi 034000，China；3.Maize Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xinzhou，Shanxi 034000，China；4.Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan，Shanxi 030000，China；5.Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministy of Agriculture，P.R.China，Taiyuan，Shanxi 030000，China）

Abstract： In this study，the genomic DNA of Lagerstroemia indica L. was isolated using improved CTAB method.The determined results of agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometer showed its good integrity，high concentration and well purity.The DNA extracted from Lagerstroemia indica L. could be used in further molecular experiment.

Key words： Lagerstroemia indica L.；DNA；improved CTAB method；isolation； determination

紫薇（Lagerstroemia indica L.）又名百日红、满堂红、痒痒树，属于千屈菜科紫薇属[1]，是一种被广泛种植的观花树种，为徐州市市花。原产于亚洲东部温带地区，在东亚分布甚广，是我国夏季主要的园林绿化树种。紫薇属落叶灌木或小乔木，高可达7 m，树冠不整齐，树皮光滑，淡褐色，嫩枝四棱；叶对生，椭圆形至柜圆形，长3～7 cm；圆锥花序顶生，花有红色、紫色。研究表明，紫薇有很多的药效[2]。

植物DNA的提取和纯化是植物基因工程研究的基础操作，实施分子标记。基因文库构建、基因分离及其遗传转化和鉴定等都以提取DNA为前提。如何简捷有效地提取到纯净、合格的大分子双链DNA，一直是植物生物技术研究者关注的问题。植物细胞不同于动物细胞，除了具有细胞壁外，还含有大量的多糖、脂质、色素和酚类物质，给DNA的提取和纯化带来许多困难。提取植物DNA常用的试剂主要是CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）和SDS（十二烷基磺酸钠）[3-6]。CTAB和SDS都可以破坏植物细胞膜，以利于细胞内容物的释放。此外，CTAB可与核酸结合形成复合物，有利于将DNA与变性蛋白质及多糖分开、SDS可与蛋白质、多糖等形成复合物，经离心与DNA分开。

国内外学者对紫薇进行了栽培繁殖、引种、新品种选育、形态分类、进化、数量分类、生理生化特性、病虫害防治等方面的研究[7-10]，对于分子生物学方面的研究不多[11-12]。由于紫薇叶片内多酚及多糖等次生代谢物质含量高，叶片DNA提取也比较困难。为此，笔者以紫薇叶片为原材料，对紫薇基因组DNA进行提取和纯化，探索出一种高效提取纯化紫薇基因组DNA的试验方法，为后续研究提供DNA原料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

采用鲜嫩的紫薇叶片。

1.2 试验方法

本试验采用改良CTAB法，具体步骤如下。

在10 mL离心管中，加入2 000 μL的2×CTAB提取缓冲液（2% CTAB，100 mmol·L-1 Tris-HCl，20 mmol·L-1 EDTA-Na2，1.4 mol·L-1 NaCl，1% PVP）和80 μL β-巯基乙醇，在65 ℃预热。

嫩的组织材料1～2 g，用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末至预热的离心管中，总体积达到3～4 mL，混匀后置65 ℃水浴锅中保温45～60 min，并不时轻轻转动离心管。

加等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻地颠倒混匀，室温下10 000 r·min-1离心10 min，移上清至另一新管中。

向管中加入1/100体积的RNAase A （10 mg·mL-1）溶液，置37 ℃、20～30 min；加入2倍体积的无水乙醇，-20 ℃放置30 min，12 000 r·min-1离心10 min，回收DNA沉淀；用70%乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于50 μL的灭菌ddH2O中。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性；用紫外分光光度计测定提取DNA在波长为260 nm 和280 nm条件下的光吸收值，计算其浓度，并作纯度分析；提取的DNA于-20 ℃冰箱保存备用。

2 结果与分析

2.1 提取DNA的完整性检测

用1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测，以水为空白对照，电泳缓冲液为1×TBE，电压为80 V，电泳80 min，然后在紫外凝胶成像系统下观察成像，获得的紫薇DNA质量检测结果如图1。由图1可以看出，DNA主带很清晰，无弥散带，说明提取的DNA有较好的完整性。

2.2 提取DNA的浓度和纯度测定

取少量纯化的紫薇DNA，稀释50倍，在紫外分光光度计下测定其波长在260 nm和280 nm的光吸收值，并计算A260/A280值和DNA浓度（表1）。

表1显示，提取的DNA具有较高的浓度，达到了440 ng·μL-1，但纯度一般，可能有多酚及多糖等次生代谢物质污染。

3 讨论

由于紫薇叶片内多酚和多糖等次生代谢物质含量高，为避免紫薇叶子中干扰DNA提取时的杂质增多，采摘幼叶效果好。研磨之前，先将叶子放入4 ℃冰箱保存2 d，消化叶子中的糖类物质；去除酚类物质，向提取缓冲液中加入β-巯基乙醇和PVP防止材料褐化。

通常研磨材料的方法是在研钵中放入材料倒入液氮速冻进行研磨，之后再将研磨好的样品转移至离心管中加缓冲液进行DNA提取。这种方法需用材料量多，操作复杂，不适于转基因植株大量样品的检测。另有报道，向离心管中加入石英砂，再倒入液氮速冻后用玻璃棒研磨，这种方法可将研磨的速度加快，但玻璃棒不如改装的与离心管吻合的螺丝批方便、快速。用改装的螺丝批研磨时，离心管中材料不宜太多，液氮要将材料冻透，研磨要充分。试验证明，研磨越充分，提取DNA的量越多。整个研磨过程都要在冰上进行，防止DNA降解。DNA提取过程中，保持低温、动作温和可有效避免DNA降解。

利用改良CTAB法从紫薇叶片中提取了基因组DNA，检测结果显示提取的DNA没有明显的降解，并有较高的浓度，纯度一般。获得的DNA可进一步用于后续分子生物学试验。

参考文献：

[1] 王献，柴永生，职永普.紫薇叶片DNA的提取及AFLP反应体系的建立[J].河南农业大学学报，2004，38（2）：189-192.

[2] 纵伟，夏文水，崔宝良，等.大叶紫薇叶中降血糖活性成分的筛选[J].食品与生物技术学报，2006，25（3）：67-71.

[3] 李荣华，夏岩石，刘顺枝，等.改进的CTAB提取植物DNA方法[J].实验室研究与探索，2009，28（9）：14-16.

[4] 单志，吴宏亮，李成磊，等.改良SDS法提取多种植物基因组DNA研究[J].广东农业科学，2011（8）：113-115.

[5] 杨立国，杨晶.5种常见植物DNA提取效率的比较[J].生物学通报，2012，47（9）：44-46.

[6] 韩玉杰，贾炜龙，王自霞，等.几种提取植物DNA方法的比较[J].山西农业科学，2008（7）：17-19.

[7] 张启翔.紫薇品种分类及其在园林中的应用[J].北京林业大学学报，1991，13（4）：57-66.

[8] 甘德欣，谭勇，龙岳林，等.紫薇和紫荆及樱花的光合特性研究[J].湖南农业大学学报，2006，32（5）：505-507.

[9] 贾文庆，刘会超，姚连芳.紫薇花粉萌发特性研究[J].西北林学院学报，2007，22（6）：18-20.

[10] 童俊，叶要妹，冯彪，等.秋水仙素诱导三种紫薇多倍体的研究[J].园艺学报，2009，36（1）：127-132.