半夏愈伤组织诱导优化研究

程霞英 杨宗岐

摘 要： 为快速诱导形成适合悬浮培养的半夏愈伤组织，对半夏愈伤诱导培养基采取了优化组合。在MS+1.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1 NAA培养基上能诱导形成浓绿、致密的愈伤组织；在MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D的培养基上，可诱导形成疏松的黄白色愈伤组织，但生长缓慢。将前者后期继代培养基配方调整为MS+0.5 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D，可较快诱导出疏松的黄白色愈伤组织，适合做悬浮培养。

关键词：半夏；愈伤组织；诱导；培养基

中图分类号：S567.2 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.09.002

Optimization Study of Callus Induction on Pinellia ternata

CHENG Xia-ying， YANG Zong-qi

（College of Life Sciences，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou，Zhejiang 310018，China）

Abstract： In order to quickly induce callus of Pinellia ternata Breit suitable for suspension culture， the optimum combination of medium was taken.The dark green and dense callus were induced on MS+1.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 NAA；and yellow and white callus were induced on MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D，but the callus grew slowly.Suitable callus could be got when the medium in the late of the former were adjusted for MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D，and could be suspended in liquid medium after 3～5 times of subculture.

Key words： Pinellia ternata；callus；induction；cultivation medium

三叶半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.（又名半夏）为天南星科Araceae半夏属Pinellia多年生小草本，株高15～30 cm，块茎近球形，叶出自块茎顶端，叶柄长6～23 cm，主产四川、湖北、河南、贵州、安徽等地。半夏是一种重要的药用植物，其块茎可入药[1-2]。据统计，在558种中药处方中，半夏的使用频率处第22位。半夏性温，味辛，有毒，传统药理作用为燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结，主要用于痰多咳喘，头痛眩晕，呕吐反胃，梅核气症等。进一步研究发现，半夏还具有抗肿瘤、抗生育、降血脂、护肝和治疗冠心病等多种重要的作用[3]。本试验对半夏愈伤组织的诱导进行进一步探究，通过调整继代过程中培养基配方，优化培养方案，提高了适合悬浮培养的愈伤组织培养效率，为半夏悬浮培养药物产业化生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

半夏块茎采自河北省易县（三叶半夏）。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的获得及处理 选取直径为1.0 cm左右的的块茎用清水洗净，在温度为28 ℃、相对湿度为80%条件下用湿沙催芽，待叶片长至3～4 cm时，取叶片及叶柄用0.1%升汞灭菌15 min，无菌水冲洗5次。叶片和叶炳分别切片和切段接种在不同激素配比的培养基上，放置于25 ℃、光照1 500 lx，10～12 h·d-1条件下进行培养。

1.2.2 诱导半夏愈伤组织的培养基设计方案 在MS培养基中添加不同激素浓度及组合（包括6-BA、2，4-D和6-BA、NAA），制成不同浓度梯度的激素培养基配方，如表1和表2所示。

1.2.3 愈伤继代[4-5] 选取生长状况良好的愈伤组织进行继代培养，每15 d继代一次。

1.2.4 半夏愈伤组织继代过程中培养基的调整 用以上2种激素组合的MS培养基进行愈伤组织的诱导，并经过2次继代后观察发现，用6-BA、2，4-D诱导的愈伤组织疏松、黄白色，但生长缓慢，且死亡率相对较高；用6-BA、NAA诱导的愈伤组织生长快，几乎无死亡现象，但是愈伤组织坚实，呈绿色，易形成丛生芽。将部分用6-BA、NAA诱导的愈伤组织经2次继代后，转到6-BA、2，4-D激素的培养基上（选择对愈伤诱导最佳的6-BA和2，4-D激素组合配方）继代，观察记录试验结果。

2 结果与分析

2.1 不同外植体形成愈伤组织的差别

将半夏外植体叶片和叶柄分别接入上述培养基中培养，2周后叶柄开始膨大，形成明显的愈伤组织，但叶片变化不明显。1个月后叶片和叶柄均可形成明显的愈伤组织，其结果如表3所示。

由表3可以看出，在15 d内用叶柄诱导愈伤组织比叶片诱导率高，而且愈伤组织生长快。30 d后，诱导率差别变得不太明显，但愈伤组织生长量差别明显。这说明虽然用叶片和叶柄均能诱导出愈伤组织，但叶柄更适合用作诱导愈伤组织的外植体。

2.2 不同激素组合对诱导半夏形成愈伤组织的影响

用6-BA、NAA和6-BA、2，4-D两种激素组合对半夏进行愈伤组织的诱导，接种1月后观察生长变化（图1、图2）。

由表4和表5可以看出，使用NAA诱导愈伤的最适激素浓度为MS+1.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1NAA，愈伤诱导率高达93.6%；使用2，4-D诱导愈伤的最适激素浓度为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D，愈伤诱导率高达92.5%。使用两种组合1个月后，对半夏愈伤组织诱导率的影响不大，但是愈伤形态差别较大。使用6-BA、2，4-D诱导出的愈伤组织松软，呈黄白色，但生长量极小；而使用6-BA、NAA得到的愈伤组织则相对坚实，多呈绿色，且生长量大。

2.3 调整继代培养基后的效果

在分别使用6-BA、NAA及6-BA、2，4-D对半夏愈伤组织进行2次继代培养（1个月）后发现，使用NAA诱导的愈伤组织依然呈绿色，而且很坚实；而使用2，4-D诱导的愈伤组织生长很慢。将部分用MS+1.0 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1NAA诱导的愈伤组织，在用相同培养基继代2次后，改用MS+0.5 mg·L-1 6-BA+2.0 mg·L-1 2，4-D继代，继代培养2～3次后愈伤组织形态改变很大，颜色由绿色变为白色或黄白色，变得很疏松（图3）。

由表6看出，虽然调整培养基后，生长速率有所减缓，但愈伤变得疏松，成黄白色，且死亡率并没有增加，所以综合比较来看，进行优化处理后的愈伤诱导培养方法效率更高，可为半夏悬浮培养药物产业化生产提供参考。

3 结 论

在半夏愈伤组织诱导过程中，叶柄比叶片更适合用作诱导愈伤组织的外植体；使用6-BA、NAA及6-BA、2，4-D组合均可得到结果。使用NAA诱导得到的愈伤组织浓绿、坚实，更易形成丛生芽；使用2，4-D得到的愈伤组织多呈黄白色、疏松，适合作悬浮培养，但愈伤生长缓慢，且死亡率相对较高。在经过2次继代培养后调整继代培养基，通过对比表明，调整培养基后的愈伤组织不仅疏松，颜色呈黄白色，且愈伤组织生长较快，适合作悬浮培养。

参考文献：

[1] 中国医科学院药物研究所.中药志（第2册）[M].第2版.北京：人民卫生出版社，1993.

[2] 张洁，杨耀文，胡建林，等.组培半夏与野生半夏的生药学初步比较研究[J].云南中医学院学报，2006，29（2）：11-14.

[3] 章艳玲，李关荣，位运粮.中药半夏的研究进展[J].中国农学通报，2007，23（7）：163-167.

[4] 范美华，周吉源，彭瑜，等.半夏愈伤组织的诱导及增殖效应[J].山东中医杂志，2005，24（3）：168-171.

[5] 罗成科，彭正松.半夏疏松愈伤组织诱导的研究[J].西华师范大学学报：自然科学版，2005，26（3）：37-41.