H1N1猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中的表达

袁芳艳 刘泽文 周丹娜等

摘要：利用 RT-PCR扩增H1N1亚型猪流感病毒HA基因，亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建分泌型重组表达载体pPIC9K-HA。将线性化的pPIC9K-HA电转化毕赤酵母菌GS115。将经MD平板筛选和PCR鉴定的阳性菌株用G418筛选多拷贝重组子。最后用1%甲醇诱导表达重组子，经SDS-PAGE和Western-blot检测， H1N1亚型猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中成功得到了表达，产物约60.4KD，并具有免疫活性。本研究为进一步研究猪H1N1亚型猪流感病毒HA基因的功能及检测方法奠定了基础。

关键词：高职；养禽与禽病防治；实践教学

中图分类号：S858.4+3 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）09-0005-03

猪流感（Swine influenza，SI）是由A型流感病毒所引起的猪的一种急性、高度传染性呼吸道疾病。临床特点为急性发热，传播迅速，发病率高，死亡率低，易引起继发感染，是危害养猪业的重要疾病之一。 随着集约化养猪规模的不断扩大，SI对养猪业构成了较大的威胁。自从1918年美国首次报道SI的暴发，1930年Shope从猪体中分离到HINl亚型SIV，迄今为止，SI已遍布亚、美、欧等地[1]。猪作为流感病毒的"混合器"，在流感病毒跨种属障碍而感染新宿主的过程中起着重要作用。2009年全球许多国家暴发了H1N1亚型流感，导致万余人死亡。SI严重威胁着人类健康，并直接关系到公共卫生及人类的生命安全。

血凝素（HA）的裂解活性为病毒具有感染性和病毒在宿主体内的传播所必需。HA基因在流感病毒识别靶细胞表面受体及穿膜过程中起重要作用，刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染，还可以刺激机体产生细胞毒性淋巴细胞（CTL）反应[2]。因此，对HA基因编码的蛋白的研究具有重要意义。本试验克隆并在酵母表达了国内分离H1亚型猪流感病毒HA，为研究HA蛋白功能及建立SI诊断方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒和菌（毒）株

大肠杆菌DH5α由本室保存；酵母-大肠杆菌穿梭质粒pPIC9K载体、毕赤酵母菌株GS115/His-4均购自Invitrogen公司；H1N1亚型猪流感病毒为本实验室分离保存。

1.2 试剂

大肠杆菌DH5α、酵母菌GS115感受态细胞、T4 DNA连接试剂盒购自爱思进生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒、M-MLV逆转录酶试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Qiagen生物有限公司； DNA marker、蛋白质marker、限制性内切酶购自大连宝生物公司；酵母氮源YNB、G418购自北京普博欣公司；HRP标记的兔抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。试验中用到的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：

P1（扩增HA成熟肽基因上游引物）：ATCTACGTAGACACACTATGT（SnaBI）

P2（扩增HA成熟肽基因下游引物）：ATCGCGGCCGCATCATAAGTTCC（NotI）

α-factor：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'

3'AOX1：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'

1.3 培养基

大肠杆菌LB培养基、酵母生长培养基YPD、选择培养基MD以及酵母诱导表达培养基BMGY/BMMY均按美国Invitrogen公司的多拷贝毕赤酵母表达试剂盒的操作手册配制。

1.4 H1N1亚型猪流感病毒RNA的提取及反转录

H1N1亚型猪流感病毒RNA的提取及反转录试验分别按照按Qiagen RNAeasyTM 公司的RNA 提取试剂盒说明书及反转录试剂盒说明书进行。1.5 H1N1亚型猪流感病毒HA基因的扩增

以反转录合成的 cDNA 为模板，利用高保真度的Kod-plus DNA聚合酶和引物P1/ P2扩增HA基因片段，反应条件为94 ℃ 5 min；35个循环（94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s）；72 ℃延伸10 min，4 ℃终止反应。取 5.0 μl PCR 产物，用 0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测鉴定后，将PCR回收产物送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.6 克隆载体pMD18T-HA的构建

合成H1N1中截去N端信号肽序列的成熟肽基因（HA），用T4 DNA连接试剂盒将合成产物和克隆载体pMD18-T于16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布卡纳抗性平板，37 ℃培养至单菌落出现。小提质粒用SnaBI/ Not I双酶切鉴定，酶切正确的质粒命名为pMD18T-HA，送上海生物工程有限公司测序。

1.7 穿梭质粒pPIC9K-HA的构建

用SnaBI/ Not I分别对HA和pPIC9K载体质粒进行双酶切、用DNA凝胶回收试剂盒回收，连接，转化DH5α，小提质粒，经酶切和测序鉴定，阳性重组质粒命名为pPIC9K-HA。取pPIC9K-HA质粒，经SalⅠ单酶切、电泳回收，得到线性化的pPIC9K-HA，置于-20℃备用。

1.8 酵母细胞的电转化及重组酵母菌株的筛选

参照Invitrogen公司的多拷贝毕赤酵母表达操作手册进行。为提高转化效率，所制备的感受态细胞立即使用。

分别将10 μg线性化的pPIC9K-HA和pPIC9K质粒，与80 μL毕赤酵母感受态细胞混匀后，注入预冷的电转杯中，冰浴5 min，进行电转化（电转参数为1500 V/25 μF/200 Ω）后，立即加入1 mL预冷的山梨醇混匀。取200～400 μL菌液涂布于营养缺陷型MD平板，28～30 ℃倒置培养2～4 d。能在MD平板上生长的菌落为His+转化子。以α-factor/3'AOX1为引物，通过菌落PCR法确认重组菌株，将PCR阳性转化子，经影印法依次接种到含G418浓度梯度为1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的YPD培养基中，筛选多拷贝重组菌株。并在MD和MM培养基上筛选表型。

1.9 重组酵母菌株的诱导表达及表达产物的检测

从含G418的YPD平板上挑取高抗性酵母菌株的单菌落于5 mL BMGY培养基中，28 ℃摇床培养24 h，离心收获细胞。将沉淀物用10mL BMMY培养基悬浮，继续28 ℃摇床培养4 d，每24 h向培养基中补加甲醇至终浓度为1%，从而保证酵母菌株的持续诱导表达。将甲醇诱导4 d的酵母菌液，离心收集上清，进行SDS-PAGE分析及Western-blot分析。Western-blot所用的一抗为鼠抗HA血清，二抗为HRP标记的兔抗鼠IgG。

2 结果

2.1 H1N1亚型猪流感病毒HA成熟肽基因的RT-PCR扩增

截去N端信号肽序列的H1N1亚型猪流感病毒成熟肽HA基因，扩增所得片段大小约1647 bp，与预期大小相符，见图1 。

2.2 重组质粒的构建与鉴定

将鉴定正确（图2）的重组质粒pMD18T-HA用SnaB I/ Not I进行酶切，鉴定正确后回收HA片段并插入相应酶切的pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K-HA，并用SnaB I/ Not I进行双酶切鉴定。由图3可知，酶切结果与预期结果9.3kb和1647bp相符。测序结果也显示，重组穿梭质粒pPIC9K-HA构建正确。

2.3 重组酵母菌株的鉴定

对在MD平板上生长的菌落，以P1/P2及α-factor/3'AOX1为引物，通过菌落PCR法初步鉴定重组菌株，用P1/P2扩增出约1647bp的条带，用引物α-factor/3'AOX1得到约1842bp（1647+195）的特意性条带，表明转化子基因组中确实整合有HA基因（图4）。

PCR阳性转化子，经G418抗性筛选，结果得到能在2.0 mg/mL G418浓度的YPD中生长的高抗性菌株。且在MD和MM培养基上进行表型筛选，挑取MD和MM培养基上均能正常生长的菌落，即基因型为His+Mut+的菌株。

2.4 表达产物的检测

挑取pPIC9K-HA/GS115酵母菌株和pPIC9K/GS115酵母对照菌株，用1%的甲醇连续诱导4 d后，取培养基上清进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果表明（图5），HA基因在毕赤酵母中成功获得了分泌表达，并且表达产物具有免疫活性。

3 讨论

血凝素（HA）是一种重要糖蛋白，是流感病毒主要的表面抗原，主要有3个功能：①在感染之前与宿主细胞表面病毒特异性受体结合；②介导病毒囊膜与核内膜的融合；③刺激机体产生中和抗体，产生免疫保护作用[3]。

大肠杆菌表达系统是基因工程中最常用的工具。具有遗传背景清楚、使用安全、操作简单、周期短、经济等特点，使用较广泛。但是它缺少真核细胞的细胞器，没有真核表达体系的蛋白翻译后加工过程，不能进行糖基化修饰，表达蛋白常常易于形成包涵体，常无其天然生物活性，需要进行复性处理。

酵母作为另一类异源蛋白表达系统有其独到之处。一方面，它属于单细胞生物，因而保留了细菌系统易于操作和生长快速的特点；另一方面，酵母又具有真核生物细胞的亚细胞结构，故具有翻译后正确的加工和修饰功能[4]。毕赤酵母的醇氧化酶1基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达[5]。而且毕赤酵母分泌的内源性蛋白少，培养基中杂蛋白含量低，表达产物既可以在胞内积累也可以直接分泌于培养基中，不需要经过细菌破碎以及复性过程，易于纯化。酵母表达系统适用范围很广，具有不含特异性的病毒，不存在内毒素残留，背景少等特点，随着酵母表达载体、宿主菌株和发酵工艺的不断改进，酵母表达系统已成为临床和工业上大规模生产外源蛋白的最佳选择[6]，也是高活性基因工程生物制品研制的重要技术。

酵母表达系统的表达受许多因素的影响，比如：外源基因A+T的组成及密码子的偏爱性，A+T含量过高会导致转录提前终止；整合的拷贝数，一般而言，基因多拷贝转化子的表达量要高于单拷贝转化子[7]。本研究利用毕赤酵母pPIC9K载体带有Kan抗性基因，在含高浓度G418（4.0mg/mL）的抗性平板筛选出高拷贝整合的转化子，成功地分泌表达了H1N1亚型猪流感HA蛋白，为HA蛋白功能研究及SI诊断方法的建立打下基础。

参考文献：

[1] 余 华. 猪流感病毒分子生物学研究进展[J]. 动物医学进展，

2010， 31（S）：208-212.

[2] 谢金文，苗立中，沈志强. 猪流感病毒蛋白研究进展[J]。中国畜牧兽医， 2009，36（11）：157-161.

[3] 赵孟孟，潘俊斌，王 衡. 猪流感病毒血凝素基因的研究进展[J]. 中国畜牧兽医， 2010， 37（11）：69-72.

[4] 姚清侠. 猪α干扰素、猪β干扰素与猪γ干扰素的抗病毒活性及其免疫佐剂的研究[D].武汉：华中农业大学， 2007.

[5] CEREGHINO J L， CREGG J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiol Rev， 2000， 24（1）： 45-66.

[6] CREGG J M， CEREGHINO J L， SHI J， et al. Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J]. Mol Biotechnol， 2000， 16（1）： 23-52.

[7] 王黎明，王 琦，梅汝鸿.巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展[J].微生物学杂志，2004，24（2）：42-45.