弯曲杆菌多重PCR检测方法的建立

张腾飞 詹丽超 罗玲等

摘要：根据弯曲杆菌属细菌细胞致死性膨胀毒素cdtABC操纵子核酸序列，针对cdtA、cdtB、cdtC设计并合成了3对特异性引物，用于建立空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和弯曲杆菌属细菌的多重PCR检测方法。试验证明，建立的多重PCR检测方法能鉴定弯曲杆菌属细菌，并区分出空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。该方法具有较好的特异性与敏感性，适合在实验室对弯曲杆菌进行检测与鉴定。

关键词：弯曲杆菌；PCR检测方法

中图分类号：S852.612 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）09-0008-02

弯曲杆菌病已经成为危害食品安全的重要食源性人兽共患病，其病原主要为空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌等弯曲杆菌属的细菌。弯曲杆菌为野生、家养动物的正常寄居菌，其中家禽为重要宿主之一，该菌在肠道内有大量细菌，感染的动物通常无明显病症，但可长期向外界排菌，通过排泄物等污染食物和饮水，从而引起人类感染，造成成人和儿童腹泻[1，2]。

利用传统的分离培养与生化鉴定方法对弯曲杆菌进行分类与鉴定比较困难与繁琐，因此有必要开发一种新的鉴定方法来鉴定弯曲杆菌。

PCR等分子生物学检测方法目前已经广泛运用到细菌的分离鉴定之中，其中多重PCR在一个反应中能同时扩增多个片段，可以方便、快捷的鉴定与区分多个菌种。

细胞致死性膨胀毒素是由cdtABC操纵子编码，是弯曲杆菌重要的毒力因子之一[3]，但是序列比对发现弯曲杆菌属中各菌种之间cdtABC操纵子存在着一定的序列差异，本研究根据菌种之间序列的保守区与差异区设计引物，建立了鉴定与区分空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和弯曲杆菌属细菌的多重PCR方法。

1 材料与方法

1.1 菌株

空肠弯曲杆菌标准菌株ATCC 33291、结肠弯曲杆菌标准菌株ATCC 43478均购自中国微生物菌种保藏中心，临床分离菌株由实验室保存。空肠弯曲杆菌与结肠弯曲杆菌均使用mCCDA固体平板或布氏肉汤在42 ℃微需氧条件下培养。

1.2 主要试剂

rTaq酶、dNTPs、DNA maker、细菌基因组提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自宝生物（大连）工程有限公司；改良CCD琼脂（mCCDA）、mCCDA添加剂购自青岛海博生物技术有限公司；布氏肉汤购自北京陆桥技术有限责任公司；微需氧产气袋和厌氧罐购自英国OXOID公司。

1.3 引物设计

参考NCBI上的空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和弯曲杆菌属其他菌株的全基因组序列，根据编码细胞膨胀毒素的cdtABC操纵子上的基因cdtA、cdtB、cdtC在各个弯曲杆菌属细菌的差异，针对cdtA设计特异性扩增空肠弯曲杆菌的引物一对，针对cdtB设计可扩增弯曲杆菌属细菌的通用引物，针对cdtC设计特异性扩增结肠弯曲杆菌的特异性引物。

1.4 模板的制备

用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，并进行适当稀释后作为PCR的模板；或者取固体平板上的单菌落，经超纯水重悬后沸水浴5 min，12 000 r/min离心5 min，冰上放置5 min，取上清作为PCR模板。

1.5 单重PCR扩增与测序

将每对引物分别以空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌标准菌株为模板进行单重PCR扩增，扩增后PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，切下DNA片段，使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6 多重PCR

经过梯度摸索dNTPs的浓度、Mg2+的浓度、Tm值，PCR反应条件为：95 ℃ 预变性5 min；然后95 ℃ 45 S，56 ℃ 45 S，72 ℃ 45 S，重复35个循环；最后72 ℃延伸5 min。

2 结果与分析

2.1 引物设计

经过弯曲杆菌属新基因序列比对发现，弯曲杆菌属细菌均含有编码细胞膨胀毒素的cdtABC操纵子，但是各菌种之间cdtABC操纵子的核苷酸序列存在一定的差异。根据保守区和差异区，我们分别设计了特异性扩增空肠弯曲杆菌cdtA基因片段的引物cdtAF、cdtAB，特异性扩增弯曲杆菌属细菌cdtB基因片段的引物cdtBA、cdtBB，特异性扩增结肠弯曲杆菌cdtC基因片段的引物cdtCF、cdtCB，引物序列见表2。

2.2 单重PCR验证引物

以空肠弯曲杆菌基因组为模板，引物cdtAF、cdtAB与引物对dtBF、cdtBB分别扩增出596 bp和467 bp的片段，经测序与空肠弯曲杆菌cdtA与cdtB基因同源性均达99%以上，引物cdtCF、cdtCB未能扩增出条带。以结肠弯曲杆菌基因组为模板，引物对cdtBF、cdtBB与引物对cdtCF、cdtCB分别扩增出467 bp与313 bp的片段，经测序与结肠弯曲杆菌cdtB、cdtC基因均达99%以上，引物对cdtAF、cdtAB未能扩增出条带。

2.3 多重PCR反应条件的优化

以空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌标准菌株基因组为模板进行PCR验证，将dNTP浓度从0.15 ～0.3 mmol/L以0.05 mmol/L为梯度递增，确定dNTP浓度为0.2 mmol/L时扩增效果较好；再将Mg2+浓度从1～3 mmol/L以0.5 mmol/L为梯度递增，确定Mg2+浓度为1.5mM时扩增效果较好。最后将Tm值从54～57 ℃以0.5 ℃为梯度递增，确定56 ℃时扩增效果较好。

多重PCR优化后扩增结果如下图所示，空肠弯曲杆菌与结肠弯曲杆菌混合菌液可以扩增出3条目的带，分别为596 bp、467 bp和313 bp；结肠弯曲杆菌菌液可以扩增出467 bp和313 bp 两条目的带；空肠弯曲杆菌菌液可以扩增出596 bp和467 bp两条带；分离的其他弯曲杆菌属细菌只能扩增出467 bp的一条带。

2.4 多重PCR的特异性与灵敏性

通过对空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、分离的弯曲杆菌属细菌和其他标准菌株（包括大肠杆菌、沙门氏菌、副鸡禽杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌等）进行特异性实验验证，实验结果显示除了弯曲杆菌属细菌能扩增出特异性条带，其他阴性参照菌株均没有扩增出条带，该结果显示多重PCR的特异性良好。

空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌标准菌株经42 ℃液体培养48 h后，进行梯度稀释和活菌计数，且每个梯度取1mL菌液制备模板进行多重PCR检测，扩增结果显示本方法对于空肠弯曲杆菌的检测灵敏度达到120 CFU，对于结肠弯曲杆菌的检测灵敏度达到100 CFU。

3 讨论

弯曲杆菌是一种食源性人畜共患病病原菌，是当今引起人类急性肠胃炎的主要病原之一。在美国，弯曲杆菌性肠炎每年导致近200万人发病，超过了志贺氏菌和沙门氏菌感染发病的总和[4]。弯曲杆菌属细菌中空肠弯曲杆菌与结肠弯曲杆菌是最常见的强致病性的菌种。家禽特别是鸡群为弯曲杆菌的主要宿主之一，通常成年鸡感染弯曲杆菌无明显症状，然而食入弯曲杆菌污染的鸡肉制品等，极易引起人类感染，导致急性肠胃炎，随后还可以引起自身免疫性并发症，如格巴氏综合征和关节炎[5]。从家禽养殖开始检测与防范弯曲杆菌，是从根源上预防弯曲杆菌病的必要手段。

弯曲杆菌病预防从检测开始，常规的微生物学程序对弯曲杆菌进行分离鉴定是一个繁琐和费时的工作。而且弯曲杆菌培养条件苛刻，传统的检测方法检出率也很不稳定，因此需要快速、高效的检测方法。通过序列比对与分析，我们针对cdtA、cdtB和cdtC设计了3对引物，建立了弯曲杆菌多重PCR检测方法，其中扩增cdtB的引物为检测弯曲杆菌属通用，可鉴定弯曲杆菌属细菌，而扩增cdtA和cdtC的引物分别为空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌特异性的，可从弯曲杆菌属中区分两者。特异性和敏感性试验显示该方法特异性检测出弯曲杆菌，并能区分空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌，而且最低检测限分别达到120 CFU和100 CFU。

该方法能够应用到食品中弯曲杆菌的污染调查，也能够应用到家禽等动物弯曲杆菌感染的疾病诊断与流行病学调查，为弯曲杆菌的检测与鉴定提供了有效的手段，也为弯曲杆菌的防范提供了工具。

参考文献：

[1] 吴蜀豫，张立实，冉 陆. 弯曲菌及弯曲菌病的流行现状[J]. 中国食品卫生杂志，2004，16（1）：58-61.

[2] 吴忠亮，朱建国，华修国. 空肠弯曲杆菌在感染鸡、猪体内分布检测[J].中国人兽共患病学报，2008，24（9）：890-891.

[3] PICKETT C L， WHITEHOUSE C A. The cytolethal distending toxin family [J]. Trends Microbiol，1999（7）：292-297.

[4] TAUXE， R V. Emerging foodborne diseases： An evolving public health challenge[J]. Emerg Foodborne Dis，1997（3）：425-434.

[5] JAVID I D， A MALIK TAREEN， et al. Campylobacter jejuni： A brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms[J]. International Journal of Medical Microbiology，2010，300（4）：205-211.