冷却羊肉贮藏中品质变化及假单胞菌生长预测模型的建立

刘莹莹　罗瑞明　卢君逸　胡聪

摘 要：为研究冷却羊肉中微生物与理化指标之间的关系及建立优势腐败菌生长预测模型，文中对冷却羊肉的多个理化指标和主要致腐微生物进行研究。实验测定了冷却羊肉在4℃条件贮藏下菌落总数、pH值、挥发性盐基氮和主要致腐微生物假单胞菌（Pseudomonas）的变化。结果表明：pH值为先下降后上升；挥发性盐基氮值（TVB-N）和失水率初期平稳上升，后期快速增大。在4、7、10、15、20℃条件下，利用Matlab7.0拟合实验数据，得到Gompertz一级模型和平方根二级模型，对预测模型在4℃和10℃条件下进行验证，准确度在20%以内，可以有效地预测冷却羊肉中假单胞菌的生长变化。

关键词：冷却羊肉；假单胞菌；pH值；挥发性盐基氮；预测模型

Predictive Modelling of Quality Changes and Pseudomonas Growth during Chilled Storage of Mutton

LIU Ying-ying，LUO Rui-ming*，LU Jun-yi，HU Cong

（School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract：The relationships between microbial and physiochemical properties for chilled mutton were investigated and predictive models for the growth of the major pathogenic bacteria Pseudomonas were established. Total bacterial colony， pH， total volatile basic nitrogen （TVB-N） and Pseudomonas count were measured during chilled storage of mutton at 4 ℃. The results showed that pH initially rose and then fell， TVB-N increased slowly at the early stage of storage and rapidly at the later stage. Gompertz models and square-root models describing the growth of Pseudomonas at 4， 7， 10， 15 ℃ and 20 ℃ were fitted with Matlab 7.0 software. The growth models at 4 ℃ and 10 ℃ were valiated. Accuracy was observed within 20%， indicating good prediction capability.

Key words：chilled mutton；Pseudomonas；pH；TVB-N；prediction model

中图分类号：TS251.53 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）05-0005-05

冷却肉是指对严格执行检疫制度屠宰后的鲜肉胴体迅速进行冷却处理，使鲜肉胴体在24h内迅速降至0～4℃，并在鲜肉后续的加工、流通和零售的过程中始终保持在0～4℃的一种新型遇冷加工肉[1]。冷却肉含有丰富的营养成分，成为未来肉类产品消费的主流[2]，但是在加工、贮藏、运输、销售过程中，由于冷链系统不够完善，容易受微生物的污染，导致冷却肉的腐败变质[3]。

引起冷却肉腐败变质的主要是一些嗜冷菌的生长活动，研究优势腐败菌的生长变化对于控制冷却肉的品质是十分关键的。利用数学预测模型可以有效地预测微生物的生长，快速对优势腐败菌的生长、存活和死亡进行预测[4]，为冷却肉的质量安全提供依据。微生物预测模型是以数学模型为基础，通过适当的试验，得到微生物与各因素之间关系数据[5]。初级模型表示微生物响应与时间关系，次级模型描述环境因子的变化如何影响初级模型中的参数[6]。

国内外对于水产品、禽肉类、牛肉、猪肉等肉类中优势腐败菌预测模型的研究已有一些报道，而对冷却羊肉中优势腐败菌预测模型建立的研究则很少有报道[7]。本实验通过研究冷却羊肉货架期低温储藏过程中，微生物的生长变化规律、分析理化指标的变化，客观的评价冷却羊肉的品质，初步了解微生物在冷却羊肉贮藏中的变化，找出微生物生长与肉品质之间的相关性[8]，建立假单胞菌（Pesudomonades）生长预测预报模型，为冷却羊肉生产中潜在危害的确定提供理论依据，最终达到对产品质量安全的控制。

1 材料与方法

1.1 材料

冷却羊肉 宁夏涝河桥牛羊肉产业有限公司。

1.2 仪器与设备

LRH-150B生化培养箱 广东省医疗器械厂；TDL-4-A青岛低速离心分离机 上海安亭科学仪器厂；LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；PHSJ-3F便携式pH计 上海精科仪器有限公司；LRH生化培养箱 上海一恒科技有限公司；HDL-APPARATUS超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

取羊后腿肉，用保鲜膜包裹，迅速转移到实验室中冷藏放置。垂直于肌纤维方向切成5cm×5cm×（1～2）cm大小的肉块，每块肉质量25.00g，分成8组，每组6块均等大小的肉块，将分组后的肉块装入托盘后以保鲜膜粘贴包装，4℃恒温培养箱中分别储存0、2、4、6、8、10、12、14d。

1.3.2 细菌菌落总数的测定

每隔1d无菌操作取25.00g羊肉，用灭菌剪刀剪碎置于均质拍打袋中，加入225mL灭菌生理盐水，用均质器拍打1min，然后按照1：10比例稀释，按照GB4789.22008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》用稀释平板法测定细菌菌落总数[9]。

1.3.3 主要腐败菌的测定

样品处理方法同上，选用以下选择性培养基进行测定。不同微生物培养条件见表1。

表 1 不同微生物的培养条件

Table 1 Culture conditions for different microorganisms

种类 选择性培养基 培养条件

乳酸菌Lactobacillus MRS 37℃、48h

假单胞菌Pesudomonade 琼脂 30℃、48h

肠杆菌E.coli VRBDA 37℃、48h

葡萄球菌Staphylococcus MSA 37℃、48h

1.3.4 pH值的测定

每隔1d取出25.00g肉样3份，作为3个平行，剪碎搅匀，分别置于烧杯中。由拍打器进行拍打后用便携式pH计按照GB9695.5—2008《肉与肉品pH测定》中的方法测冷却羊肉浸出液的pH值，每个样品测定5次，取平均值。

1.3.5 挥发性盐基氮的测定

每隔1d取相应肉样10.00g绞碎搅匀，分别置于锥形瓶中，加入100mL水，不时振摇，浸渍30min后过滤，滤液置冰箱中备用。按半微量凯氏定氮法测定挥发性盐基氮的含量[10]。

1.3.6 失水率的测定

低速离心法：离心速度为4000r/min，离心时间为 5min，试样5g。

式中：M：离心之前的质量/g；m：离心之后的质量/g。

1.3.7 优势腐败菌预测模型的建立

样品处理同上，肉块用保鲜袋包装，分别放在不同温度4、7、10、15、20℃恒温培养贮藏，每个温度取样点设置3个平行，每隔1d取样一次，测定主要腐败菌在不同恒定温度下菌落的数量。

1.3.7.1 一级模型的建立

用GomPertz方程描述不同温度条件下的生长动态[11]，GomPertz方程式如下：

式中：N（t）是微生物在时间t时菌落数的常用对数值（lg（CFU/g））；N0是随时间无限减小时渐进对数值，相当于初始菌落数的对数值（lg（CFU/g））；Nmax是增加到稳定期时最大的菌落数量对数值（lg（CFU/g））；μmax是微生物生长的最大比生长速率/h-1；Lag是微生物生长的延滞时间/h；t是贮藏时间/d。

1.3.7.2 二级模型的建立

用平方根（Belehradek）方程的描述效果简单有效[12]，方程式如下：

式中：T是培养温度/℃；Tmin是一个假设的概念，指的是微生物没有代谢活动时的温度，即在此温度是最大比生长速率为零；b是方程的常数。

将一级模型求得的Lag和对应的温度变量代入方程式，拟合出bLag、Tmin、μmax、bμmax这四个参数值。将所得参数值代回原等式，即完成二级模型的建立。

1.3.7.3 模型的验证

应用建立的微生物生长动力学模型求得4℃和10℃贮藏时的预测值，采集的肉样在4℃和10℃贮藏实验中实际检测的微生物生长数值进行比较，采用偏差度（bias factor，BF）和准确度（accuracy factor，AF）来评价已经建立的特定腐败微生物生长动力学模型的可靠性[13]。

式中：N实测是实验实际测得的微生物数量；N预测是应用微生物生长动力学模型得到的与N实测同一时间的微生物数量；n是实验次数。

1.3.7.4 数据处理

实验数据应用Matlab7.0统计软件进行相关性分析，并对模型进行拟合。

2 结果与分析

2.1 冷却羊肉贮藏过程中微生物的变化规律

在4℃贮藏条件下，实验得到微生物菌落总数的变化规律如图1所示。

图 1 4℃贮藏条件下冷却羊肉菌落总数的变化

Fig.1 Change in total bacterial colony during chilled storage of mutton at 4 ℃

从图1可看出，随着贮藏时间的增加，微生物菌落总数前6d菌落总数略微下降，从第6天开始微生物菌落总数不断增加，呈现快速增长趋势，第12天，微生物有明显的增长。原因是测定微生物总数时，可能微生物生长的延滞期或者是由于外界生长环境的改变，微生物需要适应新的环境，生长缓慢[14]。从菌落总数变化曲线上可以看出，在4℃贮藏条件下，前10d冷却羊肉中菌落总数都小于106CFU/g，达到冷鲜肉的卫生标准；从第10天开始菌落总数超过 106CFU/g，冷却肉开始变质。

2.2 冷却羊肉中特定腐败菌的初步鉴定

图 2 4℃贮藏条件下冷却羊肉主要腐败菌的变化

Fig.2 Change in major spoilage bacteria during chilled storage of mutton at 4 ℃

冷却羊肉的贮藏期间，致腐微生物是导致腐败变质的主要原因。从冷却羊肉贮藏过程中主要腐败菌的变化曲线图2中可以看出，假单胞菌是导致冷却羊肉腐败的主要微生物。新鲜肉中本来不含有肠杆菌[15]，但在加工，清洗过程中会被污染，在低温条件下，肠杆菌虽然能够生长繁殖，但不是主要的腐败菌。乳酸菌是厌氧菌，在贮藏过程中的生长繁殖会受到抑制。葡萄球菌的生长也比较缓慢，不是主要腐败菌。

2.3 冷却羊肉贮藏过程中pH值的变化规律

图 3 4℃贮藏条件下冷却羊肉pH值的变化

Fig.3 Change in TVB-N during chilled storage of mutton at 4 ℃

根据相关的标准，动物死后进入尸僵状态，pH值会发生相应的变化。肉类在低pH值的情况下，能够较好的保持新鲜度[16]。由图3可知，本实验中所选取的冷却羊肉初始pH值呈现先降低后上升的趋势。分析其原因，pH值下降一是由于肌肉中糖原酵解产生了乳酸，二是由于三磷酸腺苷分解出磷酸，乳酸和磷酸不断积累，导致羊肉的pH值的下降；但随着羊肉的成熟，在细菌和多种酶作用下，肉中蛋白质被分解成了氨类化合物等碱性物质，使pH值不断升高[17]，从图3可知，从第12天羊肉的pH值迅速升高，说明了冷却肉已开始腐败。

2.4 冷却羊肉贮藏过程中挥发性盐基氮的变化规律

图 4 4℃贮藏条件下冷却羊肉TVB-N值的变化

Fig.4 Change in water loss rate during chilled storage of mutton at 4 ℃

从图4可知，冷却羊肉所含TVB-N的量，随着冷却羊肉腐败变质的进行而不断增加，在第10天后TVB-N值迅速升高且超过15mg/100g，由此得出实验所用的冷却羊肉在第10天时已经腐败[18]。但在第14天时TVB-N值有所降低，这可能与微生物进入生长后期，活动减弱有关。

2.5 冷却羊肉贮藏过程中失水率的变化规律

图 5 4℃贮藏条件下冷却羊肉失水率的变化

Fig.5 Changes of water loss rate in chilled mutton during the storage period at 4℃

从图5可知，冷却羊肉前10d失水率缓慢上升，但是到了第10天之后，失水率迅速升高，这是因为冷却羊肉在第10天时已经腐败变质，微生物大量生长需要水分，所以失水率升高，到后期微生物生长缓慢，失水率又有所降低。

2.6 假单胞菌预测模型的建立

2.6.1 一级模型的建立

根据4、7、10、15、20℃贮藏过程中，假单胞菌的生长实验观察值，用修正的GomPertz方程回归描述假单胞菌的生长动态。试验观察值和拟合曲线如图6所示。

图 6 不同温度下假单胞菌在冷却羊肉上的生长拟合曲线

Fig.6 Fitted curves for the growth of Pseudomonas in chilled mutton at different temperatures

4、7、10、15、20℃下，假单胞菌在冷却羊肉上的生长，Matlab 7.0统计分析软件所得生长动力学参数见表2。

表 2 不同温度下假单胞菌在冷却羊肉上的生长动力学参数

Table 2 Kinetic parameters for the growth of Pseudomonas in chilled mutton at different temperatures

温度/℃ N0（lg（CFU/g）） Nmax（lg（CFU/g）） μmax Lag/h 均方误差（MSE） R2

4 3.0429 6.9241 0.0373 82.51 0.0392 0.9802

7 3.1429 7.3594 0.0562 60.12 0.0702 0.9915

10 2.9023 7.8895 0.0817 41.32 0.0452 0.9753

15 2.8583 8.1725 0.1174 29.18 0.0257 0.9813

20 3.1593 9.7478 0.1521 11.34 0.0304 0.9542

注：R2值越大，MSE值越小，回归拟合效果越好。

根据软件得出的参数，用修正的Modified Gompertz模型回归得到方程式如下：

4℃：lgN=3.0429+3.8812exp{-exp[0.2340（4.5751-t）]}

7℃：lgN=3.1429+4.2165exp{-exp[0.3340（3.5652-t）]}

10℃：lgN=2.0923+4.9872exp{-exp[0.2517 （3.8210-t）]}

15℃：lgN=2.8583+5.3142exp{-exp[0.3612 （4.2925-t）]}

20℃：lgN=3.1593+6.5885exp{-exp[0.3154 （4.7813-t）]}

由表2可得知在4、7、10、15、20℃这五种温度下的R2值均大于95%，MSE较小，说明方程均拟合得很好。

2.6.2 二级模型的建立

拟合最大比生长速率-温度（μ1/2-T）曲线和延滞期-温度（1/λ1/2-T），得到二级模型，如图7、8所示。

图 7 温度与最大比生长速率的关系

Fig.7 Temperature dependence of μmax

图 8 温度与延滞时间的关系

Fig.8 Temperature dependence of Lag

由图7、8可以看出，温度和最大生长比率及延滞时间有很好的线性关系，模型的R2分别为0.9683和0.9353，拟合方程分别为：；

。

2.6.3 模型验证

表 3 冷却羊肉在4℃和10℃贮藏时假单胞菌数量预测值的

偏差度和准确度

Table 3 Degree of deviation and accuracy for Pseudomonas growth prediction in chilled mutton at 4 ℃ and 10 ℃

贮藏温度/℃ 实验次数 偏差度（BF）/% 准确度（AF）/%

4 5 13.6 15.2

10 5 12.4 14.2

在4℃和10℃条件下，重复实验5次，得到实验数据和模型预测值的偏差度和准确度见表3。

由表3可知，实验得出的假单胞菌数量和预测模型得出的假单胞菌数量的准确度在20%以内，说明实验和模型得出的结果误差比较小，所建立的模型的准确度比较高。

3 结 论

3.1 冷却羊肉的初始菌相的差异很大，主要微生物种类主要有假单胞菌、大肠杆菌、乳酸菌、葡萄球菌，其中嗜冷菌假单胞菌的数量最多，并且随着贮藏时间的增加，表现出明显的生长优势，是冷却羊肉中主要腐败菌。冷却羊肉在第10天以后，挥发性盐基氮、失水率明显升高，从第10天开始菌落总数超过106CFU/g得出实验所用的冷却羊肉在第10天时已经腐败。

3.2 对恒定温度下的冷却羊肉建立假单胞菌的一级模型（Modified Gompertz方程），拟合度在0.95以上；平方根二级模型的R2值为0.9683，能拟合不同温度下假单胞菌的生长速率，对预测模型进行验证，准确度在20%以内，可以动态地监测冷却羊肉中假单胞菌的生长情况控制冷却肉的腐败程度，进而为判断冷却羊肉的卫生和安全提供了有效的指导意见。

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