内皮素-1诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的可能机制

肾小管上皮细胞转分化(TEMT)可促进细胞外基质(ECM)增多、沉积及肾脏结构重构，是肾间质纤维化(RIF)的重要机制之一。目前已发现高糖、转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)及血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)等均可促进TEMT。内皮素-1(ET-1)作为重要的致炎及促纤维化分子，与其受体结合后通过各种途经促进ECM增多、细胞增生、炎性细胞浸润，从而介导RIF。随着对RIF发生机制的深入研究，ET-1在TEMT中的作用越来越受到重视。目前已有学者在糖尿病肾病大鼠模型中发现ET-1与TEMT关系密切[1]，也有学者在体外细胞实验中发现ET-1可能参与了高糖诱导的TEMT[2]，但是ET-1对肾小管上皮细胞的直接作用目前研究较少。本研究应用ET-1刺激体外培养的肾小管上皮细胞并进行干预实验，观察相关指标的变化，旨在探讨ET-1是否能诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生转分化及可能的分子机制。

材料与方法

主要材料肾小管上皮细胞(NRK52E，中山大学附属第一医院肾内科余学清教授惠赠)，DMEM培养基(北京鼎国昌盛生物技术公司)，ET-1、BQ123、SB203580(美国Sigma公司)，小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体、兔抗大鼠α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)多克隆抗体(美国abcam公司)，兔抗大鼠E钙黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗体(上海生工)，兔抗大鼠p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)单克隆抗体、兔抗大鼠磷酸化-p38MAPK(p-p38MAPK)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，Western印迹设备(美国Bio-Rad公司)，反转录试剂盒(Fermentas公司)，RT-PCR扩增仪(德国Biometra公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

细胞培养及分组NRK52E于含10％牛胎血清的低糖DMEM培养基中37℃，5％CO2贴壁培养，以0.25％胰酶消化，1∶4传代，待生长至70％～80％融合时用无血清的培养基同步化12h后进行分组：阴性对照组；ET-1浓度梯度组：ET-1(10-11、10-9、10-7mol/L)刺激细胞60h；ET-1时间梯度组：ET-1(10-7mol/L)刺激细胞12h、24h、36h、48h、60h；BQ123预处理组：BQ123(2 μg/ml)预处理0.5h后ET-1(10-7mol/L)刺激细胞60h；SB203580预处理组：SB203580(10-5mol/L)预处理0.5h 后ET-1(10-7mol/L)刺激细胞60h。倒置显微镜观察各组细胞形态变化。

Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白的表达收集各组细胞，按照全细胞裂解液说明书提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。每份样本取20 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至PVDF膜上，在含5％脱脂牛奶的1×TBST中室温封闭1h。孵育一抗，加入E-cadherin抗体(1∶200)，α-SMA抗体(1∶500)，p38MAPK和p-p38MAPK抗体(1∶500)及GAPDH抗体(1∶1000)4℃过夜。次日TBST漂洗3次，10min，再用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔及马抗小鼠二抗(1∶500)室温孵育1.5h，TBST漂洗3次，10 min。DAB显色、成像。按相同实验条件重复实验3次。ImageJ软件分析目的条带灰度值。

RT-PCR法检测E-cadherin及α-SMA mRNA的表达按照TRIzol说明书在培养瓶中提取各组细胞的总RNA，经紫外线分光光度计测定RNA浓度，取总RNA 2 μg作逆转录，实验步骤参照逆转录试剂盒说明书。取2 μl逆转录产物为模板，以20 μl反应体系进行PCR扩增。引物序列：E-cadherin上游引物5’- CTACCCACGGCAAGTTCAAT- 3’，下游引物5’-GGA TGCAGGGATGAT-3’；α-SMA上游引物5’-CCCTAAAACCCTAAAGCCAACA-3’，下游引物5’-GCAGTGCATAGCCCTCGT-3’；GAPDH上游引物5’-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3’，下游引物5’-GGATGCAGGGATGAT-3’，扩增条件：E-cadherin预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30s，退火57℃ 30s，延伸72℃ 1 min，36个循环后72℃ 5 min；α-SMA退火55℃，GAPDH退火54℃，其余条件同前。将PCR产物加入1.25％琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶图像分析系统进行灰度扫描，用GAPDH作为内参计算mRNA的相对表达量，并进行3次独立实验。

统计学分析采用SPSS16.0统计软件，计量资料用均数±标准差表示，成组设计资料多个样本均数的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

ET-1、SB203580和BQ123对细胞形态的影响倒置显微镜下观察阴性对照组细胞在培养过程中始终呈典型的鹅卵石样，融合状态时细胞间连接紧密，以ET-1(10-7mol/L)刺激细胞60h后，细胞呈梭形改变，放射状排列，细胞间隙明显增大，分别应用SB203580和BQ123预处理细胞后，细胞的梭形改变明显减轻。

不同浓度ET-1对细胞E-cadherin及α-SMA表达的影响应用浓度为10-11mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L 的ET-1刺激细胞60h，各浓度组E-cadherin蛋白和mRNA的表达均低于阴性对照组(P<0.05)，并随着浓度的升高，表达逐渐减少，α-SMA蛋白和mRNA的表达均高于阴性对照组(P<0.05)，并随着浓度升高，表达增多(图1)。

ET-1作用不同时间对细胞E-cadherin及α-SMA表达的影响ET-1(10-7mol/L)刺激细胞12h、24h、36h、48h、60h，E-cadherin蛋白和mRNA的表达在36h显著减少(P<0.05)，于60h达最低值(P<0.05)，α-SMA蛋白和mRNA的表达在36h显著增加(P<0.05)，于60h达高峰(P<0.05)(图2)。

图1 不同浓度ET-1对E-cadherin及α-SMA表达的影响

图2 ET-1作用不同时间对E-cadherin及α-SMA表达的影响

ET-1、SB203580和BQ123对细胞E-cadherin、α-SMA、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达及p38MAPK磷酸化水平的影响以p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达量代表p38MAPK磷酸化水平，即p38MAPK活性。与阴性对照组相比，ET-1组E-cadherin表达减少，α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK表达增加，p38MAPK活性增强(P<0.05)；与ET-1组相比，SB203580预处理组E-cadherin表达相对增加，α-SMA及p-p38MAPK表达相对减少，p38MAPK活性减弱(P<0.05)，p38MAPK的表达无显著性差异；与ET-1组相比，BQ123预处理组E-cadherin表达相对增加，α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK表达相对减少，p38MAPK活性减弱(P<0.05)(图3)。

图3 各组细胞中E-cadherin、α-SMA、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表达和p38MAPK磷酸化水平

讨 论

近年来，TEMT与RIF的关系是国内外学者研究的热点，尽管TEMT 在RIF中的作用存在争议[3]，但是越来越多的体外细胞实验及动物模型证实了作为肌成纤维细胞(MyoF)的重要来源的TEMT具有促进RIF发生、发展的作用。

ET-1是已知作用最强和效应最持久的内源性血管收缩剂，除了改变血流动力学作用外，还是参与各种慢性肾脏疾病RIF重要的效应分子[4-6]。肾脏的固有细胞均可产生ET-1，其中肾小管上皮细胞还可通过自分泌和旁分泌ET-1导致RIF。国外学者在研究卵巢癌的发生、肺间质纤维化过程中均发现ET-1具有促进上皮细胞转分化的作用[7,8]，而ET-1是否具有诱导TEMT的作用目前尚未研究。E-cadherin是肾小管上皮细胞间紧密连接的重要成分，在保持细胞完整性中起重要作用，是上皮细胞特异蛋白之一。细胞间紧密连接破坏是上皮细胞转分化发生的关键步骤之一，抑制E-cadherin，可促进上皮细胞转分化[9]。α-SMA是具有收缩功能的细胞骨架微丝结构，是MyoF的标志蛋白。α-SMA在正常的肾小管上皮细胞几乎不表达，在转分化过程中表达增加，是上皮细胞发生转分化的标志。本实验结果发现，ET-1刺激细胞使其发生了形态学改变，由鹅卵石样变成梭形，而内皮素A受体拮抗剂BQ123预处理细胞后，细胞的梭形改变明显减弱。此外阴性对照组表达E-cadherin，而几乎不表达α-SMA，应用ET-1刺激肾小管上皮细胞后，E-cadherin表达减少，α-SMA表达增多，且呈浓度及时间依赖性，表明肾小管上皮细胞在ET-1的作用下发生了由上皮细胞表型向MyoF表型转变，而BQ123能显著抑制ET-1引起的上述效应，提示ET-1可诱导TEMT，因此ET-1的促RIF作用机制之一可能是通过ET-1诱导TEMT实现的。

p38MAPK作为MAPK家族中的一员，是细胞外信号刺激引细胞核反应的共同通路，它通过影响基因的转录和调控，进而影响细胞的生物学行为，如细胞的存活、分化及凋亡[10]。Stambe等[11]发现p38MAPK可能作为TGF-β1的下游信号分子在RIF中发挥重要作用。而在单侧输尿管梗阻大鼠RIF动物模型的研究中发现p38MAPK可能参与了肾小管间质纤维化过程[12]。Lv等[13]应用siRNA沉默p38MAPK，能显著减弱高糖诱导TEMT。这些研究提示p38MAPK信号通路与RIF及上皮细胞转分化密切相关。ET-1与其受体结合后能激活多种信号途径，如磷脂酶C、丝氨酸/苏氨酸激酶、p38MAPK级联反应等从而发挥相应的生物学效，如有研究发现ET-1能激活肾小球系膜细胞p38MAPK，进而使ECM合成增多[14,15]。p38MAPK作为ET-1下游的信号分子，能否介导ET-1诱导的TEMT，为了进一步明确ET-1诱导转分化过程中所涉及的信号通路，我们应用BQ123和p38MAPK特异性抑制剂SB203580干预ET-1刺激的肾小管上皮细胞，结果发现，ET-1能够上调p-p38MAPK蛋白的表达，增强p38MAPK活性，而用BQ123预处理后，p-p38MAPK蛋白的表达减少，p38MAPK活性减弱，表明ET-1能激活p38MAPK信号通路。此外应用SB203580能明显抑制ET-1诱导的α-SMA表达减少，E-cadherin表达增多，说明 p38MAPK信号通路可能参与ET-1诱导的TEMT过程。陈兴无等[16]观察人气管上皮下成纤维细胞转分化过程也发现，p38MAPK信号通路可介导ET-1诱导上皮细胞转分化。

本实验进一步完善了ET-1致病的作用机制，ET-1可能通过激活肾小管上皮细胞p38MAPK通路，下调E-cadherin的表达，同时上调α-SMA的表达，从而诱导TEMT。因此一定程度抑制ET-1诱导的TEMT作用，可能是防治RIF的新途径。

1 肖 舟,陈 晨,李晓照,等.冬虫夏草抑制ET-1对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞转分化作用.中国中西医结合肾病杂志,2012,13(12):1082-1085.

2 胡杨青,颜伟健,张 驰.内皮素-1 对高糖溶液培养下肾小管上皮细胞转分化的影响.临床肾脏病杂志,2012,11(12):561-563.

3 Carew RM,Wang B,Kantharidis P.The role of EMT in renal fibrosis.Cell Tissue Res,2012,347(1):103-116.

4 Maixnerová D,Merta M,Reiterová J,et al.The influence of three endothelin-1 polymorphisms on the progression of IgA nephropathy.Folia Biol (Praha),2007,53(1):27-32.

5 Chang MY,Ong AC.Endothelin in polycystic kidney disease.Contrib Nephrol,2011,172:200-209.

6 Tang L,Yi R,Yang B,et al.Valsartan inhibited HIF-1α pathway and attenuated renal interstitial fibrosis in streptozotocin-diabetic rats.Diabetes Res Clin Pract,2012,97(1):125-131.

7 Rosanò L,Spinella F,Di Castro V,et al.Endothelin-1 promotes epithelial-to-mesenchymal transition in human ovarian cancer cells.Cancer Res,2005,65(24):11649-11657.

8 Jain R,Shaul PW,Borok Z,et al.Endothelin-1 induces alveolar epithelial-mesenchymal transition through endothelin type A receptor-mediated production of TGF-beta1.Am J Respir Cell Mol Biol,2007,37(1):38-47.

9 Yang YL,Ju HZ,Liu SF,et al.BMP-2 suppresses renal interstitial fibrosis by regulating epithelial-mesenchymal transition.J Cell Biochem,2011,112(9):2558-2565.

10 高振芹,胡永斌,周建华.MAPK 信号通路与上皮间质转型.国际病理科学与临床杂志,2009,29(4):303-306.

11 Stambe C,Atkins RC,Tesch GH,et al.The role of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in renal fibrosis.J Am Soc Nephrol,2004,15(2):370-379.

12 阮颖新,林 珊,宋鸿涛,等.单侧输尿管梗阻大鼠模型中p38MAPK表达与细胞凋亡.中国病理生理杂志,2008,24(4):749-754.

13 Lv ZM,Wang Q,Wan Q,et al.The role of the p38 MAPK signaling pathway in high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition of cultured human renal tubular epithelial cells.PLoS One,2011,6(7):e22806.

14 Tsiani E,Lekas P,Fantus IG,et al.High glucose-enhanced activation of mesangial cell p38 MAPK by ET-1,ANG II,and platelet-derived growth factor.Am J Physiol Endocrinol Metab,2002,282(1):E161-E169.

15 Fang S,Jin Y,Zheng H,et al.High glucose condition upregulated Txnip expression level in rat mesangial cells through ROS/MEK/MAPK pathway.Mol Cell Biochem,2011,347(1-2):175-182.

16 陈兴无,徐 军.内皮素在诱导人气管上皮下成纤维细胞转分化中的作用.中国病理生理杂志,2007,23(6):1125-1129.