TCF7L2基因多态性与肾移植后糖尿病的相关性

2006年，Grant等[1]使用定位克隆技术发现了2型糖尿病(T2DM)的第2个易感基因——转录因子7样2基因(TCF7L2)，该基因位于10 号染色体，是迄今在欧洲、印第安、美国及亚洲人群等世界范围内重复性最好的糖尿病易感基因[1-3]。由于TCF7L2多态性显示出强烈的易感效应，得到了各国学者的广泛关注。Kang等[4]研究结果提示TCF7L2 rs7903146与韩国肾移植后糖尿病(PTDM)的发病显著相关。比利时的Ghisdal等[5]研究发现TCF7L2 rs7903146的T等位基因与PTDM显著相关。但Chang等[6]对中国台湾汉族人群的研究发现，rs7903146在中国人群中较少见，且rs7903146与中国人群T2DM无相关性，反而是位于内含子7的rs290487 与T2DM显著相关，这可能与不同人群在遗传背景上的差异所致[7]。Ren等[8]对我国汉族人群的研究则提示rs290487 与T2DM无显著相关性(P=0.071)。TCF7L2基因多态性与中国人群PTDM的相关性目前尚未见报道，基于以上对中国人群TCF7L2基因各位点多态性与T2DM相关性的研究结果，本研究选取了rs290487位点，采用实时荧光定量PCR方法，检测了398例中国肾移植患者rs290487的基因型和突变频率，分析该基因多态性与PTDM的相关性，探讨TCF7L2基因是否为PTDM的易感基因。

对象和方法

研究对象1998年～2008年在广州军区武汉总医院进行同种异体肾移植术的受者496例，排除术前合并糖尿病10例，术后失访68例，再次肾移植13例，术后第1周死亡4例和术后第1月移植肾失功3例，共398例受者入组。均采用以环孢素或他克莫司为基础的三联免疫抑制治疗方案。根据美国糖尿病协会的诊断标准，肾移植术后受者的空腹血糖(FPG) ≥7 mmol/L或使用了降糖药(胰岛素或口服降糖药)即诊断为PTDM，纳入PTDM组，其他患者纳入移植后非糖尿病组(对照组)，所有研究对象均详细记录性别、身高、移植时年龄和体重、原发肾脏病、移植时间、糖尿病家族史、透析时间、吸烟史、乙型肝炎和丙型肝炎感染史、高血压病史、尸肾或亲属移植、详细的免疫抑制治疗方案(如剂量和浓度)、肝肾功能、FPG、血脂、血压。

仪器与试剂7900HT 快速实时定量PCR仪(ABI)；离心机(Heraeus高速离心机)，WH-1 微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。Wizard DNA提取试剂盒(Promega)、TaqMan® Universal PCR Master Mix(ABI)、TaqMan® SNP Genotyping Assays(rs290487，ABI)。其余试剂为分析纯，蒸馏水经重蒸馏处理。

DNA提取与测定采用全血基因组提取试剂盒提取基因组DNA。

TCF7L2 rs290487基因型检测采用TaqMan探针法实时定量PCR检测。SNP Genotyping Assays由ABI公司提供，使用FAM和VIC作为探针的荧光标记。PCR反应体系为：2×PCR Master Mix(AmpliTaq Gold DNA 聚合酶，AmpErase UNG酶，带dUTP的dNTP，内参1，优化的缓冲液)2.5 μl，40×SNP Genotyping Assays 0.125 μl，DNA模板1.0 μl，无酶水(Nuclease-Free water)补足至5 μl。PCR反应条件：变性95℃，10 min；循环92℃ 15s，60℃ 1 min，40次。

统计学处理采用Hardy-Weinberg平衡检测基因型的分布是否具有代表性，PTDM组和对照组两组间等位基因和各基因型频率的差异采用χ2检验。采用Logistic 回归分析PTDM发病的危险因素，各变量与PTDM的关系采用单变量Logistic回归分析，单变量分析有意义的变量再采用Backward Stepwise (Likelihood Ratio)方法进行多变量Logistic回归分析。所有数据均采用SPSS11.5软件进行处理，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为统计学差异显著。

结 果

PTDM组和对照组患者的一般情况比较398例入组的肾移植受者中，97例诊断为PTDM。PTDM组和对照组受者的一般情况见表1。PTDM组患者的透析时间、移植时的年龄、体重、体质量指数(BMI)、男性患者比例均高于对照组(P<0.05或P<0.01)，两组使用他克莫司的患者比例和移植前的FPG水平无差异。

表1 PTDM组与对照组受者肾移植前一般资料

两组患者rs290487等位基因和基因型频率分布PTDM组和对照组的CC基因型分别为27.8％和18.3％，TT基因型分别为26.8％和39.2％，两组的基因型分布存在显著差异(P=0.039)，PTDM组CC基因型频率明显高于对照组，而TT基因型频率明显低于对照组(表2)。

表2 两组患者rs290487基因型分布比较

rs290487的基因分布符合 Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。PTDM组和对照组患者的C等位基因频率分别为50.5％和39.5％，T等位基因频率分别为49.5％和60.5％，PTDM组的C等位基因频率明显高于对照组，两组差异具有统计学意义(P=0.008)(表3)。

表3 两组患者rs290487等位基因频率比较

TCF7L2基因rs290487与PTDM相关性在单因素Logistic回归中，将TCF7L2基因rs290487纳入变量分析结果显示，CC基因型携带者移植术后发生PTDM的风险是TT基因型携带者的2.353倍(95％CI：1.262～4.390，P=0.007)；用性别和移植时年龄等危险因素进行校正后[9]，CC基因型携带者移植术后发生PTDM的风险是TT基因型携带者的2.411倍(95％CI：1.263～4.605，P=0.008)(表4)。本课题的前期研究结果表明[9]，男性(OR=2.104，P=0.009)、年龄 (OR=1.041，P<0.001)、体重(OR=1.040，P=0.001)和BMI (OR=1.142，P<0.001)均是PTDM发病的危险因素，因此，在多因素Logistic回归中，用性别、移植时年龄、体重和BMI等进行校正，结果发现，CC基因型仍是肾移植后发生PTDM的危险因素(表4)。

合并CC基因型和CT基因型，进行Logistic回归分析，结果表明，CC和CT基因型携带者肾移植术后发生PTDM的风险是TT基因型携带者的1.761倍(95％CI：1.062～2.919，P=0.028)；用性别和移植时年龄进行校正后，其OR=1.915(95％CI：1.136～3.228，P=0.015)；用性别、移植时年龄、体重和BMI进行校正后，其OR=1.935(95％CI：1.141～3.281，P=0.014)。该结果表明TCF7L2基因rs290487的C等位基因是肾移植后发生PTDM的独立危险因素。

表4TCF7L2rs290487与PTDM相关性的Logistic回归分析结果

TCFTL2：转录因子7样2基因；PTDM：肾移植后糖尿病；a：用性别和年龄进行校正；b：用性别，年龄，体重和BMI进行校正

讨 论

研究表明，TCF7L2由胰腺β细胞表达，与胰岛素分泌有关[10]。大量研究发现非洲裔美国人和西非人TCF7L2基因多态性与T2DM相关[7,11]，但对北非人的研究结果却与此不一致[12]。Peng等[13]的Meta-analysis纳入了全球155项相关研究的121 174个病例-对照结果表明，rs7903146、rs12255372、rs11196205、rs7901695、rs7895340和rs4506565均与T2DM显著相关(P<0.05)，但未发现rs290487、rs11196218与T2DM的相关性。

Kang等[4]研究发现TCF7L2 rs7903146与韩国肾移植患者PTDM的发病显著相关，CT基因型是其高危因素(OR=2.655，P=0.020)。Ghisdal等[5]的研究结果证实了TCF7L2 rs7903146位点的多态性与比利时肾移植患者术后发生PTDM显著相关。但Chang等[6]对台湾人群的研究显示，rs7903146在中国人群中较少见，且与中国人群T2DM无相关性， 而rs290487位点与T2DM明显相关，其CT和CC基因型的OR值分别为1.3和1.51(P<0.01)。目前国内对该位点的相关研究结果尚存在争议[14]。据报道，TCF7L2基因rs290487与辽宁[15]、济南[16]汉族人群及北京汉族人群[8]T2DM无相关性，与安徽地区汉族人群[17]和哈尔滨人群[18]T2DM则显著相关(P<0.05)。

根据以上研究结果，本研究检测了399例肾移植受者的TCF7L2 rs290487多态性结果发现， C等位基因频率为39.5％～50.5％，明显高于辽宁[15]、济南[16]及安徽地区人群[17]，而且，PTDM组的C等位基因频率明显高于对照组(50.5％vs39.5％，P=0.008)，该结果与台湾人群[6]中糖尿病组和正常对照组的基因频率(42％vs36％)分布趋势基本一致。本研究还发现，PTDM组CC基因型频率明显高于对照组，也明显高于国内普通人群和T2DM人群[15-18]。Logistic回归分析结果表明，rs290487的C等位基因是肾移植术后发生PTDM的独立危险因素，与对台湾人群[6]和安徽地区汉族人群[17]普通糖尿病的研究结果一致。

TCF7L2属于核受体家族，间接介导Wnt信号传导通路[19]。在胚胎发育过程中,胰腺和胰岛的正常发育有赖于准确的Wnt信号传导。TCF7L2 rs290487位点突变，影响了Wnt信号转导通路的级联反应，可抑制肠内分泌L细胞胰高血糖素样肽1(GLP-1)的表达，使机体血糖升高，从而导致糖尿病[20]。另一方面，TCF7L2与胰岛B细胞功能缺陷、快速急性相胰岛素分泌不足相关，该位点突变还可影响TCF7L2 及其他胰岛素相关基因的表达，从而抑制机体胰岛素的释放[21-23]。因此TCF7L2的变异可能通过直接和间接途径导致胰岛细胞分泌胰岛素不足及胰岛B细胞数量的下降。TCF7L2变异个体的表型为糖刺激后胰岛素分泌不足,但内含子的变异引起TCF7L2在胰岛B细胞表达异常及异常表达的TCF7L2蛋白如何直接降低胰岛素的分泌机制目前还不明确。而且，糖尿病是一种多基因遗传病,多个微效基因的累加作用及环境因素造成携带致病基因个体对糖尿病的遗传易感性,其中单个基因的突变对疾病的发生起很小的作用，需综合考虑整体因素的影响。

本研究纳入398例肾移植患者，样本量相对较小，而且基本是湖北汉族人，中国地域辽阔、民族众多，其他地区和民族的TCF7L2rs290487多态性是否与PTDM相关还需要进一步研究证实。

1 Grant SF,Thorleifsson G,Reynisdottir I,et al.Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.Nat Genet,2006,38(3):320-323.

2 Tönjes A,Stumvoll M.The role of the Pro12Ala polymorphism in peroxisome proliferator- activated receptor gamma in diabetes risk.Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2007,10(4):410- 414.

3 Van Dam RM,Hoebee B,Seidell JC,et al.Common variants in the ATP sensitive K+channel genes KCN(Kir6.2)and ABCC8(SUR1) in relation to glucose intolerance：population- based studies and meta- analysis.Diabet Med,2005,22(5):590- 598.

4 Kang ES,Kim MS,Kim YS,et al.A Variant of the Transcription Factor 7-Like 2 (TCF7L2) Gene and the Risk of Posttransplantation Diabetes Mellitus in Renal Allograft Recipients.Diabetes Care,2008,31(1):63-68.

5 Ghisdal L,Baron C,Le Meur Y,et al.TCF7L2 polymorphism associates with new-onset diabetes after transplantation.J Am Soc Nephrol,2009,20(11):2459-2467.

6 Chang YC,Chang TJ,Jiang YD,et al.Association study of the genetic polymorphisms of the transcription factor 7-like 2(TCF7L2) gene and type 2 diabetes in the Chinese population.Diabetes,2007,56(10):2631-2637.

7 Helgason A,Pálsson S,Thoreifsson G,et al.Refining the impact of TCF7L2 gene variants on type 2 diabetes and adaptive evolution.Nat Genet,2007,39(2):218- 225.

8 Ren Q,Han XY,Wang F,et al.Exon sequencing and association analysis of polymorphisms in TCF7L2 with type 2 diabetes in a Chinese population.Diabetologia,2008,51(7):1146-1152.

9 Yu AR,Xin HW,Wu XC,et al.Adiponectin gene polymorphisms are associated with posttransplantation diabetes mellitus in Chinese renal allograft recipients.Transplant Proc,2011,43(5):1607-1611.

10 Le Bacquer O,Shu L,Marchand M,et al.TCF7L2 splice variants have distinct effects on beta-cell turnover and function.Hum Mol Genet,2011,20(10):1906-1915.

11 Yan Y,North KE,Ballantyne CM,et al.Transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) polymorphism and context-specific risk of type 2 diabetes in African American and Caucasian adults:The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study.Diabetes,2009,58(1):285-289.

12 Alsmadi O,Al-Rubeaan K,Mohamed G,et al.Weak or no association of TCF7L2 variants with type 2 diabetes risk in an Arab population.BMC Med Genet,2008,9:72.

13 Peng S,Zhu Y,Lü B,et al.TCF7L2 gene polymorphisms and type 2 diabetes risk:a comprehensive and updated meta-analysis involving 121174 subjects.Mutagenesis,2013,28(1):25-37.

14 Zhang BC,Li WM,Zhu MY,et al.Association of TCF7L2 gene polymorphisms with type 2 diabetes mellitus in Han Chinese population:a meta-analysis.Gene,2013,512(1):76-81.

15 纪红梅,刘 巍,边 澈,等.TCF7L2 基因rs290487多态性与辽宁地区2型糖尿病发病的相关性.中国生物制品学杂志,2012,25(6):740-742.

16 张 勇,荣海钦,王 辉,等.TCF7L2基因rs290487多态性与2型糖尿病相关研究.实用糖尿病杂志,2009,5(3):27-29.

17 朱 晖,王佑民,许 敏,等.生物芯片快速检测糖尿病风险基因TCF7L2 rs290487位点.安徽医科大学学报,2011,46(1):20-23.

18 Qiao H,Zhang X,Zhao X,et al.Genetic variants of TCF7L2 are associated with type 2 diabetes in a northeastern Chinese population.Gene,2012,495(2):115-119.

19 Ip W,Shao W,Chiang YT,et al.The Wnt signaling pathway effector TCF7L2 is upregulated by insulin and represses hepatic gluconeogenesis.Am J Physiol Endocrinol Metab,2012,303(9):E1166-1176.

20 Jin T,Liu L.The Wnt signaling pathway effector TCF7L2 and type 2 diabetes mellitus.Mol Endocrinol,2008,22(11):2383-2392.

21 Palmer ND,Lehtinen AB,Langefeld CD,et al.Association of TCF7L2 gene polymorphisms with reduced acute insulin response in Hispanic Americans.J Clin Endocrinol Metab,2008,93(1):304-309.

22 Savic D,Ye H,Aneas I,et al.Alterations in TCF7L2 expression define its role as a key regulator of glucose metabolism.Genome Res,2011,21(9):1417-1425.

23 Mondal AK,Das SK,Baldini G,et al.Genotype and tissue-specific effects on alternative splicing of the transcription factor 7-like 2 gene in humans.J Clin Endocrinol Metab,2010,95(3):1450-1457.