法舒地尔对腹膜透析大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响

长期腹膜透析(PD)可使腹膜结构和功能发生改变，包括腹膜间皮细胞脱落、腹膜间皮细胞转分化(EMT)及腹膜纤维化[1,2]。它可引起腹膜功能减退，超滤失败，最终导致PD失败。大量研究表明，转化生长因子β1(TGF-β1)在PD相关性腹膜EMT和纤维化中起着至关重要的作用[3-5]。

Rho激酶(Rho-kinase)是Rho蛋白下游效应器，可磷酸化其下游靶点,如肌球蛋白轻链和肌球蛋白轻链磷酸酯酶(MYPT1)。Rho/Rho-kinase对许多细胞活动(如血管平滑肌细胞收缩、肌动蛋白细胞骨架重组、细胞黏附和移动、胞质分裂、细胞增生和基因表达等)具有重要的调节作用[6]。有研究提示Rho kinase可通过调控TGF-β1通路在细胞转分化及组织纤维化中起非常重要的作用，Rho-kinase抑制剂可下调肾脏TGF-β1表达，从而减轻肾脏α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及肾纤维化的发生[6-9]。

Rho-kinase在PD相关腹膜EMT及纤维化中的作用尚无报道。因此,本研究旨在探讨通过使用Rho-kinase抑制剂法舒地尔阻断Rho/Rho-kinase信号通路是否能防治PD引起的腹膜EMT及腹膜纤维化,并为临床防治提供实验依据。

材料与方法

材料

实验动物 雄性SD大鼠(二级，由中南大学湘雅医学院动物实验中心提供)，体重180～200g。

主要试剂 4.25％葡萄糖透析液购于Baxter公司；驴抗兔FITC；碘化丙啶(DAPI)购于Sigma公司；Trizol购于Invitrogen公司；法舒地尔购于Sigma公司；MYPT1购于Sigma公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体购于santa cruz公司；小鼠抗大鼠α-SMA多克隆抗体购于DAKO公司；兔抗大鼠E钙黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗体购于santa cruz公司。

方法

分组 24只二级SD大鼠随机分为4组：正常组6只；PD模型组6只，每天腹腔灌注4.25％葡萄糖透析液[按100 ml/(kg·BW)计算]；法舒地尔5 mg组(Fas 5 mg组， 6只)，每天腹腔灌注4.25％葡萄糖透析液及法舒地尔5 mg/(kg·d)；法舒地尔10 mg组(Fas 10 mg组， 6只)，每天腹腔灌注4.25％葡萄糖透析液及法舒地尔10 mg/(kg·d)。连续4周，于第4周行腹膜功能试验后处死大鼠，分别留取腹膜脏、壁层组织于4°PLP液中固定9 h。同时留取腹膜脏层组织，置-80℃冰箱保存。

腹膜功能试验 各组大鼠于第4周行腹膜功能试验，试验前48h停止PD。用10％水合氯醛麻醉大鼠，然后腹腔注射25 ml 4.25％透析液，4h后沿腹部正中切口打开腹腔，准确量取腹腔液体。计算每只大鼠的超滤量。

超滤量=(最后出水量-25)ml

Western Blot检测腹膜组织Rho-kinase活性 采用MYPT1为抗体检测Rho-kinase活性。取200 mg脏层腹膜组织，碾碎后加入0.4 ml的细胞裂解液超声粉碎， 4℃，15 000 r/min离心15 min，取上清测蛋白质浓度。取相同质量的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5％的脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入磷酸化MYPT1及MYPT1抗体(Rho激酶底物)，4℃过夜，TBST洗膜后用HRP标记的IgG室温孵育1h，洗膜后显色，凝胶成像分析系统扫描分析。

免疫荧光检查 免疫荧光检测脏层腹膜TGF-β1、α-SMA、E-cadherin表达。PLP固定石醋包埋的组织切片经二甲苯、乙醇脱醋脱水，用枸橼酸钠缓冲液微波修复抗原，5％BSA于37℃封闭30 min，分别加入TGF-β1、α-SMA、E-cadherin一抗4℃过夜后，加FITC标记的二抗于37℃孵育1 h，然后用DAPI染核，缓冲甘油封片，最后用激光共聚焦显微镜观察，随机观察10个视野，以单位面积的荧光强度为单位进行荧光半定量分析。

Western Blot检测腹膜组织蛋白表达 取200 mg腹膜组织，碾碎后加入0.4 ml的细胞裂解液超声粉碎， 4℃，15 000 r/min离心15 min，取上清测蛋白质浓度。取相同质量的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5％的脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入兔抗大鼠TGF-β1、小鼠抗大鼠α-SMA、兔抗大鼠E-cadherin，及GAPDH抗体，4℃过夜，TBST洗膜后用HRP标记的抗兔、小鼠IgG室温孵育1 h，洗膜后显色，凝胶成像分析系统扫描分析。

RT-PCR检测腹膜脏层mRNA表达 用RT-PCR方法检测脏层腹膜TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA的表达。引物序列从Genebank中查阅，根据引物设计原则，利用Primer Premier 5软件设计。序列分别为：GAPDH (725 bp) 上游：5’-G￣G￣C￣A￣A￣G￣T￣T￣C￣A￣A￣T￣G￣G￣C￣A￣C￣A￣G￣T-3’，下游：5’-A￣A￣G￣G￣T￣G￣G￣A￣G￣G￣A￣A￣T￣G￣G￣G￣A￣G￣T￣T-3’；TGF-β1 (432 bp)上游：5’-C￣T￣G￣T￣C￣C￣A￣A￣A￣C￣T￣A￣A￣G￣G￣C￣T￣C￣G￣C-3’,下游：5’-A￣G￣A￣C￣A￣G￣C￣C￣A￣C￣T￣C￣A￣G￣G￣C￣G￣T￣A-3’；E-cadherin(354 bp) 上游：5’-C￣A￣G￣G￣A￣T￣T￣A￣C￣A￣A￣G￣T￣T￣C￣C￣C￣G￣C￣C￣A-3’，下游：5’-C￣A￣C￣T￣G￣T￣C￣C￣G￣C￣T￣G￣C￣C￣T￣T￣C￣A￣G-3’；α-SMA(558 bp)上游：5’-G￣C￣T￣C￣T￣G￣T￣A￣A￣G￣G￣C￣G￣G￣G￣C￣T￣T￣T￣G-3’。下游：5’-A￣C￣G￣A￣A￣G￣G￣A￣A￣T￣A￣G￣C￣C￣A￣C￣G￣C￣T￣C￣A-3’。

采用Trizol一步法提取腹膜组织的RNA。cDNA的合成(逆转录)参照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒操作程序进行。反应体系50 μl，反应条件：94℃ 3 min预变性，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，共33～35个循环，72℃延伸10 min。反应后取5ul PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳。应用凝胶成像及图像分析系统分析结果。

统计方法采用SPSS 17.0软件包进行数据分析。计量资料用算术均数±标准差描述，两组以上均数比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为统计学差异显著。

结 果

腹膜组织Rho-kinase活性首先采用Western blot方法检测腹膜组织Rho-kinase活性，分别检测磷酸化MYPT和总MYPT。如图1所示，与正常组大鼠比较，PD大鼠腹膜组织Rho-kinase活性显著增加，而法舒地尔呈剂量依赖模式降低Rho-kinase活性。Fas 10 mg组抑制Rho-kinase活性作用明显优于Fas 5 mg组(P<0.05)。

图1 磷酸化pMYPT/总MYPT光密度标准化比值

法舒地尔对腹膜功能的影响如图2所示，与正常组大鼠比较，PD大鼠腹膜超滤量显著减少，腹膜功能明显下降。而法舒地尔呈剂量依赖模式增加PD大鼠超滤量、改善腹膜功能，Fas 10 mg组改善腹膜功能作用明显强于Fas 5 mg组(P<0.05)。

图2 法舒地尔抑制腹膜超滤量丧失

法舒地尔对腹膜组织TGF-β1蛋白及基因表达的影响免疫荧光、Western Blot和RT-PCR显示，与正常组大鼠比较，PD大鼠腹膜组织TGF-β1蛋白及mRNA表达明显上调(P<0.01);而与PD模型组比较，法舒地尔呈剂量依赖模式下调PD大鼠腹膜组织TGF-β1蛋白及mRNA表达，Fas 10 mg组比Fas 5 mg组下调更明显(P<0.05)(图3)。

法舒地尔对腹膜组织α-SMA、E-cadherin蛋白及基因表达的影响我们同时检测腹膜组织转分化指标α-SMA、E-cadherin蛋白及基因的表达。免疫荧光、Western Blot和RT-PCR显示，与正常组大鼠比较，PD大鼠腹膜组织α-SMA蛋白及mRNA表达明显上调(P<0.01);而法舒地尔呈剂量依赖模式下调PD大鼠腹膜组织α-SMA蛋白及mRNA表达，Fas 10 mg组比Fas 5 mg组下调更明显(P<0.05)(图4)。

免疫荧光、Western Blot和RT-PCR显示，与正常组大鼠比较，PD大鼠腹膜组织E-cadherin蛋白及mRNA表达明显下调(P<0.01);而法舒地尔呈剂量依赖模式上调PD大鼠腹膜组织E-cadherin蛋白及mRNA表达，Fas 10 mg组比Fas 5 mg组上调更明显(P<0.05)(图5)。

讨 论

PD是终末期肾病(ESRD)患者最主要的替代治疗方法之一。然而长期PD可引起患者腹膜纤维化，导致超滤失败，最终导致患者退出PD[1，2]。因此，深入探讨腹膜纤维化的机制，对于预防和延缓纤维化的发生具有重要的意义。腹膜间皮细胞是腹膜组织的主要细胞，PD时腹膜间皮细胞发生EMT是引起腹膜纤维化的始动和可逆环节，是重要的致纤维化机制。本研究用4.25％葡萄糖透析液建立PD大鼠模型发现,该大鼠模型磷酸化MYPT1水平明显升高，证实Rho/Rho-kinase信号通路被显著激活，并介导腹膜EMT及纤维化的发生。

Rho家族属于小G蛋白超家族成员，它在多种细胞活动中发挥重要作用，参与调节细胞的生长、分化、迁移以及炎性细胞的黏附、吞噬等功能[6，7]。近年来，许多研究显示Rho/Rho-kinase信号通路在多种组织细胞EMT及纤维化中也扮演重要角色[9-11]。Wu等[10]研究发现，Rho-kinase抑制剂法舒地尔能显著下调糖尿病肾病大鼠肾α-SMA蛋白及mRNA表达，上调E-cadherin蛋白及mRNA表达，从而改善肾小管上皮细胞转分化，减轻肾纤维化的发生。Washida等[11]也发现，法舒地尔可下调腹膜α-SMA和纤维连接蛋白的蛋白表达，改善腹膜纤维化。本研究也发现PD大鼠腹膜α-SMA蛋白及mRNA表达显著上调，腹膜间皮细胞E-cadherin蛋白及mRNA表达显著下调，而法舒地尔能呈剂量依赖模式下调腹膜α-SMA蛋白及mRNA、上调腹膜间皮细胞E-cadherin蛋白及mRNA表达，明显减轻腹膜EMT的发生。本研究同时发现法舒地尔呈剂量依赖模式增加PD大鼠超滤量、改善PD大鼠腹膜功能。这表明Rho/Rho-kinase信号通路在腹膜EMT及腹膜纤维化中起重要作用。

已有研究表明，TGF-β1信号通路在多种组织细胞EMT及纤维化中起重要作用，且通过抑制TGF-β1信号通路可显著减轻EMT、纤维化的发生[3-5]。我们既往研究也发现TGF-β1信号通路在腹膜EMT及纤维化中也起关键作用[5]。进一步研究发现，Rho/Rho-kinase信号通路可能是通过调控TGF-β1通路而发挥其调控EMT及纤维化的作用。研究表明Rho-kinase抑制剂可下调TGF-β1蛋白及mRNA表达，进而抑制细胞外基质及α-SMA表达[11-16]。我们发现PD大鼠腹膜TGF-β1蛋白及mRNA表达显著上调，而法舒地尔能呈剂量依赖模式下调腹膜TGF-β1蛋白及mRNA表达。

综上所述，法舒地尔可显著改善PD大鼠腹膜EMT的发生，并明显改善腹膜功能，其机制可能与其调控TGF-β1信号通路密切相关。本研究表明，Rho/Rho-kinase信号通路在PD大鼠腹膜EMT及纤维化中起重要调控作用。因此，抑制Rho/Rho-kinase信号通路激活可有效阻止腹膜EMT，保护腹膜功能，为改善腹膜功能和结构提供新的治疗靶点。

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