GLP-1可拮抗Ghrelin对离体大鼠胰岛分泌胰岛素的抑制

张松筠, 杨长春, 王瑞英, 张力辉, 李彩格, 姜慧卿



GLP-1可拮抗Ghrelin对离体大鼠胰岛分泌胰岛素的抑制

张松筠1, 杨长春2, 王瑞英1, 张力辉1, 李彩格1, 姜慧卿*3

（河北医科大学第二医院:1内分泌科,3消化内科, 石家庄 050000;2武警总医院南楼一科, 北京 100039）

Ghrelin; 胰高血糖素样肽-1; 大鼠; 胰岛; 胰岛素

胰岛素是机体调节血糖水平的主要激素。Ghrelin主要由胃分泌，可增进食欲，促进能量正平衡，调节血糖水平，诸多研究证明，Ghrelin可明显抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌[1-3]。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）由肠道分泌，可以抑制胃肠动力，减慢胃排空速率，减少胰岛β细胞凋亡，促进胰岛β细胞的增殖和分化，刺激胰岛素分泌[4-6]。本实验采用体外培养的方法，观察GLP-1及Ghrelin对离体大鼠胰岛分泌胰岛素的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠（200g左右），河北医科大学动物室提供（合格证编号DK0408-0089）。

1.2 实验试剂

Ghrelin（Phoenix公司），GLP-1（Bachem公司），胶原酶V（Sigma公司），胎牛血清（Hyclone公司），Ficoll（Pharmacia公司），RPMI 1640培养液（Hyclone公司），HEPES-缓冲液、PBS、葡萄糖、平衡盐溶液、Hanks液、双硫腙染料（河北博海生物工程有限公司），胰岛素放射免疫药盒（中国原子能科学院同位素研究所）。

1.3 胰岛分离消化[7]

SD大鼠，脱颈处死后于无菌条件下取出胰腺，置于37℃Hank¢s液中剪碎（1mm×1mm×1mm大小），加入胶原酶V（1g/L），在37℃的恒温水浴箱中振荡消化至瓶内组织成糊状，并立即吸出细颗粒状组织，4℃Hank¢s液终止消化。收集上层细胞悬液，过500目滤网，离心5min（1000r/min），弃上清液。将分离所得胰岛细胞悬浮于4ml 25%的Ficoll-400分离液中，为建立密度梯度，依次加入23.0%、20.5%和11.0%的Ficoll-400分离液各2ml，4℃离心（15min，800r/min），收集1.077、1.084 kg/L，1.068、1.077kg/L与1.038、1.068 kg/L界面的细胞团，洗涤后取少量做双硫腙染色，10 min后镜检，鉴定为胰岛后，手挑法显微镜下取出直径50μm以上的胰岛。

1.4 孵育

将分离所得胰岛置于37℃、5% CO2恒温箱中，应用RPMI 1640（含10%胎牛血清）孵育过夜，之后换入含3.3mmol/L葡萄糖的HEPES-缓冲液预孵1h（对照组），去上清，再分别移入葡萄糖液（高糖组）、葡萄糖+Ghrelin液（Ghrelin组）、葡萄糖+GLP-1液（GLP-1组）、葡萄糖+Ghrelin+GLP-1液（Ghrelin+GLP-1组）继续孵育1h，提取上清液，应用放射免疫法测定胰岛素浓度。孵育液中葡萄糖浓度为16.7mmol/L，Ghrelin浓度为10-6mmol/L，GLP-1浓度为10-3mmol/ L。每组12孔，每孔约含10个胰岛。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 胰岛成功分离消化

应用胰岛分离消化的方法分离胰岛细胞，经双硫腙染色10 min后镜检鉴定为胰岛（图1），用于实验。

图1 分离纯化后的胰岛细胞团

Figure 1 Separated and purified islet cell mass (dithizone staining ×200)

2.2 Ghrelin对高糖诱导的胰岛素分泌的影响

图2结果表明，高糖组胰岛素浓度为（18.12±4.71）mmol/L，与对照组（7.37±0.17）mmol/L相比明显升高（＜0.01），证实高浓度葡萄糖（16.7mmol/L）可刺激胰岛分泌胰岛素。

Ghrelin组胰岛素浓度为（11.93±3.57）mmol/L，与高糖组相比明显降低（＜0.05），提示10-6mmol/L的Ghrelin对高浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌有显著的抑制作用。

GLP-1组胰岛素浓度为（27.29±8.12）mmol/L，明显高于高糖组（＜0.05），提示10-3mmol/L的GLP-1可以显著增强高浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

GLP-1+Ghrelin组胰岛素浓度为（16.7±5.34）mmol/L，明显高于Ghrelin组（＜0.05）。提示10-3mmol/ L的GLP-1可拮抗10-6mmol/L Ghrelin对高糖诱导的胰岛素分泌的抑制作用。

图2 Ghrelin对高糖诱导的胰岛素分泌的影响

Figure 2 The effect of Ghrelin on high glucose-induced insulin secretion

与对照组比较,**＜0.01; 与高糖组比较,#＜0.05; 与Ghrelin组比较,△＜0.05

3 讨 论

Ghrelin是生长激素促泌剂受体（growth hormone secretagogue receptor，GHS-R）的内源性配体，具有广泛的生理功能。循环中70%的Ghrelin来源于胃粘膜，但RT-PCR、免疫组化、原位杂交等多种实验均证实Ghrelin同样存在于胰岛[7]，并可以通过旁分泌或自分泌的方式抑制高糖诱导的胰岛素分泌。本实验中Ghrelin组胰岛素浓度明显低于高糖组，再次证实这一结论。

GLP-1由小肠L-型内分泌细胞在食物中的碳水化合物和脂肪的刺激下分泌，可以促进胰岛素分泌，抑制胰升糖素释放。近来研究表明GLP-1还可阻止胰岛β细胞凋亡，促进β细胞新生。本实验中GLP-1组胰岛素浓度明显高于高糖组（＜0.05），证实10-3mmol/L的GLP-1可刺激胰岛β细胞，显著增加胰岛素分泌。

本研究显示，当10-6mmol/L Ghrelin与10-3mmol/L GLP-1共同作用于胰岛β细胞时，胰岛素分泌明显高于Ghrelin组。提示：10-3mmol/L GLP-1可以拮抗10-6mmol/ L Ghrelin对胰岛素分泌的抑制。

[1] Sakurada T, Ro S, Onouchi T,. Comparison of the actions of acylated ghrelin on acid secretion in the rat stomach[J]. J Gastroenterol, 2010, 45(11): 1111-1120.

[2] Meyer C. Final answer: Ghrenlin can suppress insulin secretion in humans，but is it clinically relevant[J]? Diabetes, 2010, 59(11): 2726-2728.

[3] Vestergaard ET, Djurhuus CB, Gjedsted J,. Acute effects of Ghrelin administration on glucose and lipid metabolism[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2008, 93(2): 438-444.

[4] 王庆美, 季 红, 荣海钦, 等. 不同胰岛素促泌剂对胰岛β细胞凋亡的影响[J]. 医学研究杂志, 2010, 39(3): 97-101.

[5] 刘玉溥, 吕庆国, 童南伟. 大鼠胰岛β细胞分离与原代培养方法探讨[J]. 四川大学学报(医学版), 2009, 40(1): 153-156.

[6] Klinger S, Poussin C, Debril MB,. Increasing GLP-1-induced beta-cell proliferation by silecing the negative regulators of signalling cAMP response element modulator-alpha and DU SP14[J]. Diabetes, 2008, 57(3): 584-593.

[7] 陈 芳, 马凤霞, 池 颖, 等. 一种高效诱导胚胎胰腺细胞分化为内分泌细胞培养方法的建立[J]. 中国医学科学院学报, 2012, 34(4): 343-347.

（编辑: 周宇红）

R587.1

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00037

2012-11-25;

2012-11-25

河北省科学技术研究与发展项目（No. 062761834）

姜慧卿, Tel: 0311-66002955, E-mail: huiqingjiang@yahoo.com.cn