不同氮浓度对紫球藻生长及藻胆蛋白和叶绿素a含量变化的影响

郑彩云，卢伟婷，王 艳，张崇禧*

（山东大学威海分校 海洋学院，山东 威海 264209）

紫球藻（Porphyridiumcruentum）属于红藻门（Rhodophyta），红毛菜纲（Bnagiophyeeae），紫球藻目（Porphyridium hrtidiales），紫球藻科（Porphyridium hyridiaceae）。紫球藻属（Porphyridium nageli.）是一种比较原始的单细胞红藻，其广泛分布于海水、淡水及潮湿的土壤中，其细胞呈球形，大约8μm～15μm，细胞外包围着一层粘质鞘，因粘质鞘的相互粘连而使多个细胞不规则的聚成一团，固体培养形成一个薄层，液体培养则出现附壁或呈团状沉淀现象。紫球藻在生长过程中能够合成藻胆蛋白、高不饱和脂肪酸及硫酸脂多糖等多种生物活性物质，其应用领域涉及医药、保健食品、化妆品、精细化工等多种高附加值产业，是一种极具研究应用价值的经济微藻。

目前，紫球藻的研究主要集中在培养工艺的优化改良，特别是其多种生物活性物质的开发利用方面，而盐度对紫球藻生长代谢影响的报道甚少。在紫球藻培养方面，虽然通过大量实验优化了各种生长影响因子，初步建立了光生物反应器的高密度培养体系，但其实际培养效果无论从藻体的数量还是质量方面都与规模化、商业化生产要求存在一定的差距。本论文对不同氮磷浓度条件下紫球藻的生长代谢进行了系统的研究，得到了不同氮磷浓度对藻体的生长特性及叶绿素、藻胆蛋白单位积累量的影响，以期为进一步细化紫球藻的高密度培养工艺提供实验理论与依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验藻种

紫球藻（Porphyridium cruentum）实验用藻株系由山东大学威海分校海洋学院分离纯化和筛选的纯种，采用f/2海水培养基保种培养。

f/2海水培养基成分：硝酸钠74.8mg/L，磷酸二氢钠0.2g/L。

f/2微量元素1mL/L（硫酸锌23mg/L、氯化锰178mg/L、硫酸铜10mg/L、乙二胺四乙酸二钠4.35mg/L、氯化钻12mg/L、柠檬酸铁3.9g/L、氯化钻12mg/L、四氧化钼8mg/L）。

1.1.2 实验海水

实验所用海水取自山东大学威海分校近海海域，120℃高温灭菌20min后使用。

1.2 仪器与试剂

JYD-650L超声波细胞粉碎机：上海之信仪器公司；LXJIIR低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；721E型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

实验所用药品、试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 藻体计数

取1mL藻体稀释10倍，以0.1血球计数板在光学显微镜下直接计算藻细胞数量。

1.3.2 接种紫球藻

配制NaNO3母液（20g/L）KH2PO4母液（20g/L）。

在5个培养管中都加入2mL KH2PO4溶液、0.2mL微量元素、25mL种子液，再分别加入0.748mL、1.748mL、4.748mL、8.7488mL、12.748mL NaNO3溶液，每管加海水至体积为200mL，由此配出氮的浓度梯度为0、0.1g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.2g/L，通入空气培养并设置一组平行组。

1.3.3 叶绿素a含量测定

经研究证实，用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm，则叶绿素a的测定误差为2%，叶绿素b为19%，鉴于此点选择叶绿素a作为藻生物指标检测质。

取80mL藻液1500r/min离心10min，弃上清液用PBS洗2次，每次加入量5mL；洗好后弃上清，加入95%vol乙醇5mL避光振荡后放入4℃冰箱黑暗提取24h，5000r/min下离心10min，上清液在波长665nm、649nm处测量光密度值，根据公式计算叶绿素a含量：叶绿素a（mg/L）=13.95×OD665－6.88×OD649。

1.3.4 藻胆蛋白含量的测定

用离心法采收鲜藻，定量藻泥用PBS（磷酸盐缓冲液）溶解，-20℃反复冻融3次，然后放入离心管置冰浴中，分别以120W的功率破碎细胞，以超声10s，间歇10s的方式进行处理，处理40次。离心后取上清液，测定藻胆蛋白含量，以磷酸缓冲液做空白对照，分别测定波长620nm、650nm、680nm处的吸光度值，利用经验公式计算藻胆蛋白含量[2]。

2 实验数据与分析

2.1 不同NaNO3浓度对紫球藻生长的影响

不同NaNO3浓度时紫球藻的生长曲线（图1）可知，不同NaNO3浓度时各组藻细胞的生长趋势基本相同。接种后各实验组的藻体均处于静止适应阶段，由于紫球藻存在附壁的特性以及适应新环境，导致培养液的细胞密度明显下降。从第2d开始，藻体进入对数生长期，生物量迅速增大。不同NaNO3浓度对紫球藻生长趋势影响较小，但NO3-含量的增加明显有助于提高紫球藻的生长速率。当NaNO3的添加量为0时，仅依靠海水中的本底硝酸盐，紫球藻也能出现对数生长，但由于NO3-的缺乏，藻体生长速度均低于添加组。

2.2 不同NaNO3浓度对紫球藻代谢产物的影响

2.2.1 不同NaNO3浓度对紫球藻叶绿素a含量的影响

由图2可知，随着NaNO3浓度升高，紫球藻叶绿素a含量明显增多。NaNO3添加量为0时，实验组总体叶绿素a含量和单位细胞叶绿素a的含量明显低于其他各组。当NaNO3的添加量为0.4g/L、0.8g/L、1.2g/L时，藻体生长出现优势，叶绿素a含量相对较高。叶绿素含量的多少在一定范围内与NaNO3浓度呈现一定的依赖性。

图1 不同NaNO3浓度下紫球藻的生长曲线Fig.1 Growth cuvres of Porphyridium cruentum at different concentration of NaNO3

图2 不同NaNO3浓度下紫球藻叶绿素a含量变化图Fig.2 The effect of different concentration of NaNO3 on the content of mebolic products

2.2.2 不同NaNO3浓度对紫球藻藻胆蛋白含量的影响

图3 不同NaNO3浓度下紫球藻藻胆蛋白含量变化图Fig.3 The effect of different concentration of NaNO3 on the content of mebolic products

由图3可知，随着NaNO3浓度升高，紫球藻藻胆蛋白积累含量明显增多。NaNO3添加量为0时，该组总体藻胆蛋白含量和单位细胞的藻胆蛋白积累含量明显低于其他各组。当NaNO3的添加量为0.4g/L、0.8g/L、1.2g/L时，藻体生长出现优势，藻胆蛋白含量相对较高。藻胆蛋白含量的多少在一定范围内与NaNO3浓度呈现一定的依赖性。

附表 不同NaNO3 浓度对单个紫球藻细胞代谢产物含量的影响Attached table The effet of diefferent concentration of NaNO3 on mebolic products of unit cell

3 讨论

3.1 不同NaNO3浓度对紫球藻生长趋势的影响

不同NaNO3浓度下各组藻细胞的生长趋势基本相同，接种后各实验组藻体处于静滞适应阶段。由于紫球藻存在附壁的特性以及需要适应新环境，培养液的细胞密度明显下降。第2d开始进入对数生长期，生物量迅速增大。不同NaNO3浓度对紫球藻生长趋势影响较小，但其含量增加明显有助于提高紫球藻的生长速率。当NaNO3添加为0时，仅靠海水中的硝酸盐，紫球藻也能出现对数生长，但由于氮的缺乏，藻体生长几天后随即进入静止期。NaNO3高剂量组明显体现出生长优势，其细胞密度始终高于各组对照。不同氮浓度对紫球藻生长趋势影响较小，但氮含量的增加明显有助于提高紫球藻的生长速率并延长其对数生长期。

3.2 不同NaNO3浓度对紫球藻代谢产物积累的影响

随着NaNO3浓度升高，紫球藻叶绿素a与藻胆蛋白积累含量量明显增多。第一组单位细胞的各项产量明显低于其他各组。NaNO3添加量较低时，由于氮元素缺乏，消耗部分蛋白提供氮元素，又因叶绿素含量的偏低直接影响了藻体光合作用的能力及细胞对培养基中碳源的利用，细胞合成色素蛋白不足，最终导致其细胞数量上的差别；故蛋白含量较低。紫球藻在不同NaNO3浓度时生长稳定期所含叶绿素a及藻胆蛋白的总量与藻体生长呈明显的正相关规律，即藻体稳定期细胞密度越大，代谢产物含量越高。

3.3 紫球藻积累产物在生产中的应用及发展新方向

紫球藻作为一种被培养利用的海洋单细胞红藻，因其在生长过程中合成藻胆蛋白、多不饱和脂肪酸（花生四烯酸、二十碳五烯酸等）和硫酸脂多糖等天然活性物质，具有很大的经济价值及广阔的应用前景。硒（Se）是一种与人类健康密切相关的必需微量元素，是构成生物体内若干抗氧化物酶的活性中心。研究证实，硒具有清除自由基、防衰老、抗癌等生物学功能，含硒的生物大分子如硒蛋白、硒多糖具有抗氧化、增强免疫、预防肿瘤等多种生理功能。而叶绿素a及藻胆蛋白等有助于硒的富。因此，对紫球藻进行培养，并对其藻胆蛋白和叶绿素a的含量进行了测定，为以后进行紫球藻富集转化硒等研究提供一定的理论基础。

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