双水相萃取分离红豆蛋白质

2013-04-23孙亚莉张喜峰

中国酿造 2013年6期

孙亚莉，张喜峰*

（河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖 734000）

红豆又称赤豆、小豆、赤小豆、饭豆，为一年生豆科植物，色泽鲜红、淡红或深红。已有研究证明，红豆中含有蛋白质、脂肪、淀粉、膳食纤维、B族维生素等营养物质[1-3]。因此，红豆具有较高营养价值。我国对红豆蛋白质开发利用有限，高效充分提取蛋白质，促进红豆蛋白功能食品加工可持续发展，以期为红豆蛋白利用开辟新的途径。

红豆蛋白质现有分离纯化技术包括：碱溶酸沉法[4]、酶解法[5-6]、微波辅助提取法[7]。碱溶酸沉法易导致蛋白质构象变化，蛋白质发生聚集。酶解法周期较长，在分离提取蛋白质同时引入酶组分，增加分离纯化难度。微波辅助提取法仅适用于热稳定性物质的提取，对于热敏性物质，微波加热可能使其变性或失活。微波萃取过程中细胞因受热而破裂，一些不希望得到的组分也会溶解于溶剂中，从而使微波萃取的选择性显著降低。双水相萃取操作条件温和、处理量大、易于连续操作、且蛋白质能保持其天然的空间构型，不易失活[8]。

采用Plackett-Burman设计法对影响红豆蛋白萃取率相关影响因素的效应进行评价，运用最陡爬坡试验以及Box-Behnken设计，得到双水相萃取红豆蛋白质最佳萃取条件，旨在为红豆蛋白质的分离纯化和开发利用提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红豆购自甘肃省张掖市新乐超市；PEG（600、1000、2000、4000、6000）：天津市光复精细化工研究所；硫酸铵、磷酸、考马斯亮蓝G-250：上海中秦化学试剂有限公司；牛血清蛋白、氯化钠：天津市光复科技发展有限公司；95%vol乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：天津市百世化工有限公司。

PL203电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；XO-SM5O超声-微波反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；DKB-501数显超级恒温水浴锅：扬州市三发电子有限公司；DHG-9101.1电热恒温鼓风干燥箱：扬州市三发电子有限公司；722型分光光度计：上海光谱仪器有限公司；CR-21高速离心机：日本日立；漩涡混合器：上海精科实业有限公司；小型粉碎机：扬州市三发电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗提液的制备

称取10g红豆粉末，置于1000mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中在恒温30℃条件下浸提60min。在超声波反应系统下对红豆蛋白进行提取，将得到的悬浊液于6000r/min离心10min，倾倒上清液可得到含红豆蛋白质的粗提液，测定粗提液中蛋白质含量。

1.2.2 考马斯亮蓝G-250测定蛋白含量[9]

取5支试管，分别精确吸取牛血清蛋白原液0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL，用蒸馏水全部稀释至1.0mL，然后分别加入5.00mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，于（25±1）℃的恒温水浴中保温10min，冷水浴中冷却后，立即于波长595nm处比色测定。以1.0mL蒸馏水代替样品液，加入5.00mL考马斯亮蓝溶液，其余操作同上，作空白对照。

1.2.3 双水相系统相图制作[10]

精确称取质量分数为50%、不同相对分子质量的PEG于试管中，加入1g ddH2O，用滴定管缓慢滴加已配好的质量分数为40%（NH4）2SO4溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管中溶液开始出现浑浊为止。记录（NH4）2SO4的添加量（g）。然后加水，使其澄清，继续向试管中滴加（NH4）2SO4溶液并不断混匀，直至再次达到混浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，PEG和（NH4）2SO4在系统总量中的质量分数（g/g），以PEG的质量分数为纵坐标，（NH4）2SO4的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。

1.2.4 双水相萃取方法

固定体系总质量为10.00g，加入适量的PEG和（NH4）2SO4，充分振荡使成相物质溶解，同时完成了红豆蛋白在双水相系统中的分配过程，在一定条件下萃取。此双水相系统静置一定时间，当两相达到相分离，红豆蛋白富集于双水相系统的上相中，读取上下相体积，求相比R；分别测定上下相蛋白质浓度，计算红豆蛋白的分配系数K及萃取率Y，如下式：

1.2.5 Plackett-Burman（PB）试验设计

在前期试验的基础上，选取可能影响双水相萃取蛋白质的7个因素进行Plackett-Burman设计，每个因子取高（+1）和低（-1）2个水平，响应值为萃取率（Y）。试验因素、水平及编码见表1。

1.2.6 最陡爬坡试验

响应面拟合方程只有在考察是区域里才能充分近似真实情况，所以先逼近最大萃取率区域后才能建立有效的拟合方程。根据PB试验筛选出显著因子，进行最陡爬坡试验，以期寻找到最大萃取率。

1.2.7 响应面分析

响应曲面分析法（RSM）中的试验设计（Box-Behnken）是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。本试验利用Design-Expert 7.16数据处理软件设计一个3因素3水平共17个试验点的试验，得到最佳的双水相萃取条件，各因素及其水平见表2。

表1 Plackett-Burman 试验设计因素水平范围Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken 试验因素与水平Table 2 Levels and factors of Box-Behnken experiment

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

用紫外可见分光光度计测波长595nm处吸光度值，绘制蛋白总量-吸光度值标准曲线，以试管中牛血清白蛋白的总量（μg）为横坐标，相应的吸光度值（A）为纵坐标作标准曲线，得到其线性方程为y=0.0059x+0.0245（R2=0.9939）。

2.2 不同相对分子量PEG/（NH4）2SO4双水相体系相图

在室温条件下，测定不同分子量PEG/（NH4）2SO4双水相体系相图，结果见图1。考虑到萃取是在两相条件下进行的，因此选择在双节线上方的质量分数点作为单因素的参考条件。

图1 不同相对分子质量PEG与(NH4)2SO4的双水相相图Fig.1 Phase diagram of different relative molecular mass PEG and(NH4)2SO4 in aqueous two-phase system

由图1可知，当硫酸铵质量分数一定时，随着PEG相对分子质量的增大，形成双水相体系所需PEG的浓度降低。因为PEG相对分子质量越大，其憎水程度越强，且加大与硫酸铵分相的动力，导致临界分相浓度降低[11]。

2.3 双水相系统中PEG相对分子质量的确定

PEG/（NH4）2SO4双水相体系中，在PEG质量分数为20%，（NH4）2SO4质量分数为20%，室温条件下萃取30min，改变PEG的分子量，比较双水相体系中红豆蛋白的分配情况，结果见图2。

图2 PEG相对分子质量对红豆蛋白质分配行为的影响Fig.2 Effects of relative molecular of PEG on partitioning behaviour of red bean protein

由图2可知，成相聚合物的相对分子质量是影响分配平衡的重要因素，降低聚合物的相对分子质量，则蛋白质分配于富含该聚合物的相中。降低PEG的相对分子质量，红豆蛋白的分配系数和萃取率总体上呈现上升的趋势，是因为PEG分子量减小时，其疏水性显著减弱，使红豆蛋白在上相的表面张力减小，从而易于向上相分配[12]。综合考虑，5种PEG中，PEG2000的萃取效果最好，并且红豆蛋白在PEG2000-（NH4）2SO4体系中的分配系数最高，故选PEG2000为双水相系统成相物质。

2.4 Plackett-Burman试验设计影响因素水平

Plackett-Burman试验设计结果见表3。

利用Design-Expert 7.16软件对Plackett-Burman试验结果进行方差分析，各因素的影响效果见表4。由表4可知，7种影响因子中，萃取pH值（C）、萃取温度（D）、NaCl质量分数（E），对红豆蛋白萃取率影响较大。其中，萃取pH值（C）、NaCl质量分数（E）对红豆蛋白萃取率的影响是正效应，萃取温度（D）对红豆蛋白萃取率的影响是负效应。由此确定萃取pH值（C）、萃取温度（D）、NaCl质量分数（E）3个因子对红豆蛋白萃取率的影响最为显著。不显著因素表现为正效应的取高水平，表现为负效应的取低水平。

2.5 最陡爬坡试验

由表4的Plackett-Burman试验设计结果分析表明，萃取pH值、NaCl质量分数对红豆蛋白萃取率的影响是正效应，应增加。萃取温度对红豆蛋白萃取率的影响是负效应，应降低。根据Plackett-Burman法筛选出的显著因子效应大小设计其的步长，进行最陡爬坡试验，以期寻找到最优萃取条件。其他因素选用Plackett-Burman试验中1和-1水平的平均值[13-15]。本试验采用Plackett-Burman法进行试验设计，试验设计和结果见表5。

表3 Plackett-Burman 试验设计结果Table 3 Results of Plackett-Burman design

表4 PB 实验参数估计Table 4 Coefficient estimates of variables in PB design

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table5 Design and results of steepest ascent experiment

由试验结果可以看出，随着3种关键因子的变化，红豆蛋白萃取率先上升后下降，在试验3的组合下红豆蛋白萃取率最大，因此选择该组合作为中心组合设计的0水平值进行下一步的优化试验设计，即萃取pH值、萃取温度、NaCl质量分数，分别为7.4、32℃、0.15%。

2.6 Box-Behnken试验

2.6.1 Box-Benhnken试验设计

根据最陡爬坡确定的试验因素中心点，采用Box-Behnken设计对双水相萃取红豆蛋白质条件进行3因素3水平的响应面优化，其设计及结果见表6。

表6 Box-Behnken 试验设计与结果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiment

2.6.2 Box-Benhnken试验数据分析

表7 Box-Behnken 试验结果的回归分析Table 7 Regression analysis of Box-Behnken experiment results

以红豆蛋白萃取率Y为响应值，根据表6的试验结果，用Design-Expert8.0.5.0软件进行多元回归分析，具体结果见表7。经回归拟合后，试验因子对响应值的影响可用以下回归方程表示：

方差分析显著性检验表明，R2=92.62%，方程回归性显著。分析结果见表7。

对该模型进行方差分析，该模型X2、X12、X22对响应值的影响显著，说明萃取温度对响应值的影响显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序：萃取温度＞萃取pH值＞NaCl质量分数。本模型拟合程度明显，失拟项p=0.2372，没有显著性意义。从而证明该模型的拟合是合适的。对该模型进行可信度分析，R2=0.9262，说明该模型能解释响应值变化的92.62%，模型拟合程度好。

2.6.3 显著因素水平的优化

利用Design-Expert8.0.5.0软件根据回归方程进行响应面分析，绘制响应面图和等高线图，结果见图3，每个响应面分析图分别代表着两个因素之间的的交互情况。由图3可知，响应面变量Y有最大值，即X1、X2和X3存在极值点。

此回归模型得出Box-Benhnken试验的最佳萃取条件为萃取pH值为7.5，NaCl质量分数为0.145%，萃取温度为33℃，红豆蛋白萃取率的理论值为49.54%。

2.6.4 验证试验

为检测模型与试验结果是否一致，根据以上确定的萃取条件进行3组试验验证，得到红豆蛋白萃取率为50.27%，与预测值49.54%基本一致，说明该方法与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面法适用于对红豆蛋白萃取工艺进行回归分析和参数优化。

3 结论

采用Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验、响应面法，确定双水相体系组成为PEG2000质量分数为20%、（NH4）2SO4质量分数为20%、pH值为7.5、萃取温度33℃、NaCl质量分数为0.145%时，红豆蛋白质萃取率可达50.27%。因此，利用响应面分析方法对红豆蛋白质的萃取条件进行优化，可以获得最优的工艺参数，能有效的减少工艺操作的盲目性，从而为进一步的试验研究奠定基础。