桂林市汉族老年非酒精性脂肪性肝病与脂联素基因启动子区-11377C/G单核苷酸多态性的相关性研究

叶 瑶，于 健，汪琳姣，江仁美，陆桂荣，胡永玲

随着经济飞速发展、人口老龄化，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成为我国第一大慢性肝病，且与美国、西欧、日本等发达国家流行趋势相似。NAFLD是由多种病因引起的一组综合征，占脂肪肝总数的90%以上，且NAFLD患者大多伴有心血管危险因素，与心脑血管疾病密切相关[1-2]。脂联素(APN)是一种由脂肪细胞分泌的激素，具有促进脂肪酸氧化、调节胰岛素敏感性、抗动脉粥样硬化等作用，是调节糖代谢和脂质代谢的重要因子，与NAFLD的发病及病情进展密切相关。研究显示，脂联素部分位点单核苷酸多态性与NAFLD的发病及病情严重程度相关[3-4]，但以上研究的结论并不完全一致，可能是由于研究效能和种族人群多态性位点选择的差异造成的。本研究旨在探讨桂林市汉族老年NAFLD与脂联素基因启动子区-11377C/G单核苷酸多态性的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2012年7—11月在桂林医学院附属医院体检中心诊断为NAFLD者150例为NAFLD组，其中男85例，女65例；年龄59～74岁，平均(66.2±4.0)岁；另选择同期与NAFLD组年龄匹配的体检正常者130例为对照组，其中男82例，女48例；年龄56～78岁，平均(65.8±4.1)岁。两组性别构成(χ2=1.189)、平均年龄(t=0.636)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。受试者为汉族，均签署知情同意书。

1.2 NAFLD诊断标准 参照中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2006版)》[5]，凡具备下列(1)～(5)中任一项和(6)或(7)项者即可诊断为NAFLD：(1)无饮酒史或饮酒(换算成乙醇)量男性<140 g/周，女性<70 g/周；(2)除外病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性等可导致脂肪肝的特定疾病；(3)除原发病的临床表现外，有乏力、消化不良、肝区隐痛、肝脾肿大等非特异性征象；(4)有超重/内脏性肥胖、空腹血糖增高、血脂紊乱、高血压等代谢综合征相关组分；(5)血浆转氨酶和γ-谷氨酰转移酶水平可有轻至中度增高(<5倍参考值的上限)，通常以丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平增高为主；(6)肝脏影像学表现符合弥漫性脂肪肝的影像学诊断标准；(7)肝活检组织学改变符合脂肪性肝病的病理学诊断标准。

1.3 观察指标

1.3.1 身体测量指标 所有受试者测量前至少30 min内避免饮酒、吸烟、运动及饮用含咖啡因的饮料，统一测量身高、体质量、血压，计算体质指数(BMI)，BMI=体质量(kg)/身高2(m2)。测量身高时免冠、脱鞋，数值精确至0.01 m；测量体质量时免冠、脱鞋，空腹、排空膀胱，数值精确至0.1 kg；采用水银柱血压计测量右臂肱动脉血压，测量2次取平均值，数值精确到1 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。

1.3.2 实验室检查指标 所有受试者隔夜禁食10 h，于次日晨起空腹抽取肘静脉血，采用罗氏公司Cobas C501全自动生化分析仪检测空腹血糖(FBG)、ALT、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、尿酸(UA)；其中FBG的检测采用葡萄糖氧化酶法，ALT、AST的检测采用速率法，TG的检测采用GPO-POD酶法，TC的检测采用胆固醇氧化酶法，HDL-C的检测采用磷钨酸-镁法，LDL-C的检测采用SUR法，UA的检测采用尿酸酶法。

1.4 脂联素基因启动子区-11377C/G单核苷酸多态性检测 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP法)：(1)DNA提取：所有受试者清晨空腹抽取静脉血2 ml，EDTA抗凝，用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司生产)提取基因组DNA，-20 ℃保存，统一测量。(2)PCR扩增：引物设计参照文献[6]，上游引物序列为5′-TGG TGG ACT TGA CTT TAC TGG TAG-3′，下游引物序列为5′-TAG AAG CAG CCT GGA GAA CTG-3′，由上海英潍捷基贸易有限公司合成；PCR反应体系为25.0 μl：模板DNA 2.0 μl，上下游引物各0.5 μl，2×MasterMix(北京天根生化科技有限公司生产)12.5 μl，ddH2O 9.5 μl；PCR反应条件：95 ℃预变性5 min后进入主循环，变性94 ℃ 45 s，退火62 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，共30个循环，终末延伸72 ℃ 7 min，扩增产物4 ℃暂存；PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳及EB染色，采用凝胶成像系统拍照并判断扩增结果(见图1)。(3)酶切鉴定基因型：酶切体系为20.0 μl：PCR产物10.0 μl，HhaI限制性内切酶(北京纽英伦生物技术有限公司生产)0.5 μl，10×NEB缓冲液2.0 μl，100×BSA 0.2 μl，ddH2O 7.3 μl；酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳及EB染色，采用凝胶成像系统拍照并根据条带判断基因型：脂联素基因启动子区-11377C/G单核苷酸经限制性内切酶HhaI酶切产生3种条带，其中CC型不能被酶切，表现为1个条带，CG型被酶切为2个条带，GG型被酶切为3个条带(见图2)。

2 结果

2.1 两组观察指标比较 NAFLD组BMI、SBP、DBP、FBG、ALT、TG、TC、LDL-C及UA水平均高于对照组(P<0.05)，HDL-C水平低于对照组(P<0.01)；两组AST水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.2 NAFLD影响因素分析 以上述观察指标为自变量并结合专业知识进行赋值(见表2)，以是否患NAFLD为因变量(否=0，是=1)，行单因素Logistic回归分析，结果显示性别、BMI、高血压、FBG、TG、HDL-C、LDL-C、UA进入回归方程(P<0.05)；采用向前逐步引入法校正混杂因素，行非条件多因素Logistic回归分析，结果显示性别、BMI、TG、UA进入回归方程(P<0.05，见表3)。

2.3 两组脂联素基因启动子区-11377C/G基因型和等位基因频率比较 经Hardy-Weinberg平衡检验，本研究样本脂联素基因启动子区-11377C/G基因型具有群体代表性(χ2=1.482，P=0.223)；两组脂联素基因启动子区-11377C/G基因型和等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表4)。

2.4 不同基因型受试者观察指标比较 NAFLD组和对照组不同基因型受试者BMI、SBP、DBP、FBG、ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C及UA水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表5～6)。

表2 NAFLD影响因素的Logistic回归模型中的变量赋值

Table2 Variable assignment in Logistic regression model of influencing factors of NAFLD

变量赋值性别男=0，女=1BMI(kg/m2)<25=0，≥25=1高血压无=0，有=1FBG(mmol/L)<61=0，≥61=1ALT(U/L)≤38=0，>38=1AST(U/L)≤40=0，>40=1TG(mmol/L)<226=0，≥226=1TC(mmol/L)<622=0，≥622=1HDL-C(mmol/L)<155=0，≥155=1LDL-C(mmol/L)<414=0，≥414=1UA(μmol/L)≤420=0，>420=1

注：M为DNA Marker，1～10均为脂联素基因启动子区-11377C/G单核苷酸PCR扩增产物

图1 脂联素基因启动子区-11377C/G单核苷酸PCR扩增产物电泳图

Figure1 PCR result of SNP-11377C/G of APN

注：M为DNA Marker，1，2，4，6，8为CC型；3，9为CG型；5，7，10为GG型

图2 脂联素基因启动子区-11377C/G单核苷酸酶切产物电泳图(限制性内切酶HhaI酶切)

Figure2 Enzyme result of SNP-11377C/G of APN

表1 两组观察指标比较

注：BMI=体质指数，SBP=收缩压，DBP=舒张压，FBG=空腹血糖，ALT=丙氨酸氨基转移酶，AST=天冬氨酸氨基转移酶，TG=三酰甘油，TC=总胆固醇，HDL-C=高密度脂蛋白胆固醇，LDL-C=低密度脂蛋白胆固醇，UA=尿酸

表3 NAFLD影响因素的单因素和多因素Logistic回归分析

表5 NAFLD组不同基因型受试者观察指标比较

注：*为H值

表6 对照组不同基因型受试者观察指标比较

注：*为H值

表4 两组脂联素基因启动子区-11377C/G基因型和等位基因频率比较〔n(%)〕

Table4 Comparison of genotypes and allele frequencies of SNP-11377C/G of APN between the two groups

组别例数基因型CC CG GG等位基因C G对照组13083(638)40(308) 7(54) 206(792)54(208)NAFLD组15091(607)49(327)10(66)231(770)69(230)χ2值03810404P值08270525

3 讨论

NAFLD是一种与遗传易患性和胰岛素抵抗密切相关的获得性代谢应激性肝损伤，也是一种与高胰岛素血症、2型糖尿病(T2DM)、肥胖密切相关的临床病理综合征[4]，胰岛素抵抗是其共同发病机制。本研究结果显示，与对照组相比，NAFLD组BMI、SBP、DBP、FBG、ALT、TG、TC、LDL-C及UA水平明显升高，HDL-C水平明显降低，表明NAFLD患者易合并超重和/或肥胖、高血糖、血脂紊乱和高血压等，NAFLD是代谢综合征累及肝脏的表现，同时NAFLD也是代谢综合征的重要组分。

多因素Logistic回归分析通过控制其他混杂因素的影响，研究某一因素对目标疾病的作用，进而提高研究结果的可靠性。NAFLD是由多种因素或疾病引起的疾病，本研究进行的非条件多因素Logistic回归分析结果显示，性别、BMI、TG、UA是NAFLD的独立危险因素，危险度由大到小依次为BMI、 UA、TG、性别。Miyake等[7]研究发现，BMI是NAFLD最有效的预测因子，本研究结果与之一致，提示控制体质量有助于预防NAFLD的发生、发展。而女性在更年期后卵巢功能衰退，雌激素对内脏脂肪增加的抑制作用减弱可能与NAFLD的发生、发展有关。

“脂毒性”可损害胰岛β细胞的分泌功能，并抑制骨骼肌对葡萄糖的摄取，使肝脏糖异生作用增强，进而加重胰岛素抵抗和高血糖[8]，而慢性高血糖症的“糖毒性”则可通过氧化应激对胰岛β细胞功能造成慢性、进行性的不可逆损伤，降低胰岛素分泌功能并引起胰岛素抵抗[9]。胰岛素抵抗通过高胰岛素血症和脂解作用两种机制使脂质由脂肪细胞向非脂肪细胞(尤其是肝细胞)内转移，造成肝细胞脂肪堆积，进而形成NAFLD。NAFLD时脂质代谢失调，增多的游离脂肪酸(FAA)干扰了胰岛素与受体的结合，产生胰岛素抵抗；FAA可损害肝细胞，而肝细胞脂肪堆积则影响肝细胞氧化代谢及能量转换，导致肝功能受损，血清ALT、AST水平升高；长期高游离脂肪酸血症可使胰岛β细胞功能受损，导致胰岛素分泌障碍和胰岛素抵抗，从而诱发或加重糖代谢异常，最终形成“胰岛素抵抗-糖毒性-NAFLD-脂毒性”的恶性循环。翟木绪等[10]研究表明，高尿酸血症与NAFLD的发病密切相关，其可能原因为胰岛素抵抗相关高危因素的聚集及其共同的病理生理机制。本研究结果显示，NAFLD组FBG及UA水平高于对照组，与以上研究结果一致。

研究表明，脂联素与NAFLD关系密切，低脂联素血症在抑制NAFLD的发生中可能起着重要作用[11]。脂联素可通过影响肝脏脂肪代谢、炎性因子产生及周围组织对胰岛素的敏感性等阻断其对肝脏的初次打击及二次打击，从而抑制NAFLD发生与进展。人脂联素基因位于染色体3q27，而该区域存在代谢综合征、T2DM和冠心病的易感位点。人脂联素单核苷酸多态性通过影响脂联素基因表达而调控脂联素水平。脂联素基因启动子区包括5′侧翼区、外显子1和内含子1，其中，位于5′侧翼区的-11377C/G与血清脂联素水平相关[12]。

目前，关于NAFLD与脂联素单核苷酸多态性关系的研究较少，且有关脂联素单核苷酸多态性与NAFLD发病易患性关系的研究结果并不一致。Wong等[13]研究发现，脂联素基因启动子区-11377G和+45G等位基因与NAFLD患者的高三酰甘油血症相关；Gupta等[3]研究发现，脂联素基因启动子区-11377C/G和+45T/G与NAFLD患者的血清脂联素水平降低相关；Tokushige等[14]研究表明，脂联素基因启动子区+276、+45位点及肝纤维化、胰岛素抵抗可能参与了NAFLD的发病。石胜利等[4]研究发现，脂联素基因启动子区276T/T和45G/G基因型可能是我国汉族人群NAFLD的易感基因，而黄春明等[15]则认为脂联素基因启动子区T45G多态性与NAFLD的发病易患性无关。本研究结果显示，两组脂联素基因启动子区-11377C/G基因型和等位基因频率比较，均无明显差异；不同基因型受试者BMI、SBP、DBP、FBG、ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C及UA水平比较，亦均无明显差异，表明桂林市汉族老年NAFLD与脂联素基因启动子区-11377C/G单核苷酸多态性无明显相关性。但本研究未检测血浆脂朕素水平，不能分析血浆脂联素水平与NAFLD发病的相关性，也无法阐明脂联素基因启动子区-11377C/G单核苷酸多态性是否通过影响血浆脂联素水平而对 NAFLD产生影响，所得结论也不能排除民族、地域差异以及本研究样本含量较小的影响。

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