酪氨酸激酶2基因多态性与汉族人群急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的关联研究

娄 涛，李文强，顾家鹏，李时光，顾仁骏，张 萍，王夏红，张红星，

李 巍，张红亚，赵建民，潘 登，李 静，靳 玫，吴 强

急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning,ACMP)是较常见的职业性及生活性中毒，可造成以中枢神经系统及心血管系统功能损害为主的全身各组织细胞的损伤[1]。部分ACMP患者经治疗意识清醒后,经过3～60 d〔平均(23.8±14.0)d〕表现正常或接近正常的间歇期，会出现急性一氧化碳中毒后迟发性脑病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)，该病是以痴呆、精神失常和锥体外系症状为主要表现的一组神经精神症状。DEACMP的影像及病理改变主要为双侧苍白球对称性软化灶和大脑白质广泛的脱髓鞘，海马区亦有不可逆损害等[2-3]。目前认为急性中毒后缺氧损伤导致血-脑脊液屏障开放产生的自身免疫反应是其重要的病理机制[4-5]，但年龄、性别类似且中毒程度相同的患者发生概率又有很大的差别，提示存在个体间的差异，推测个体遗传因素可能起到了重要的作用。DEACMP的早期病理改变—脑白质广泛的脱髓鞘及晚期病理改变—脑萎缩等特点均与多发性硬化(multiple sclerosis,MS)类似，两者同属于获得性中枢神经系统脱髓鞘疾病，在脑部病理损伤中有着许多共同之处。关于DEACMP的基因研究目前相关报道较少。本实验选取MS易患基因酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TYK2)[6-7]的rs10876994和rs34536443位点，研究TYK2基因多态性与DEACMP的遗传易患性之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2006年10月—2010年10月在新乡医学院第二附属医院、新乡市中心医院等11家医院急诊科和神经内科住院的ACMP昏迷患者224例，鉴于30岁以下DEACMP患者极为罕见，为了达到相对匹配，研究对象入组年龄定为40岁以上。DEACMP符合内科学第六版诊断标准[1]，ACMP符合国家职业性ACMP诊断标准GB8781-88。均排除以下情况：过敏史；近2周内发生感染；接受过免疫抑制剂治疗及激素治疗；近半年内接受过预防接种；严重的心、肝、肾疾病；中枢神经系统疾病；严重的糖尿病、内分泌疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤、营养不良、酒精依赖及其他精神疾病；妊娠、哺乳及月经期妇女。由于DEACMP的假愈期最长为60 d，因此对ACMP患者均随访90 d以上，根据是否出现DEACMP分为两组。DEACMP组共109例，其中男55例，女54例；年龄42～89岁，平均(59.7±9.7)岁。ACMP时均有昏迷史，昏迷持续时间(发现昏迷到意识清醒的时间)2～72 h，平均(16.1±15.1)h。间歇期(ACMP昏迷清醒后到出现迟发性脑病症状的时间)7～45 d，平均(20.3±9.4)d。ACMP组共115例，其中男50例，女65例；年龄40～84岁，平均(56.1±7.4)岁。ACMP时均有昏迷史，昏迷持续时间1～51 h，平均(6.8±7.5)h。两组均为豫北地区汉族患者，两组间性别、年龄具有均衡性。经新乡医学院第二附属医院伦理委员会批准，所有入组对象或其法定监护人均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 所有受试者采集外周静脉血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝低温冻存待用。采用天根生化科技RelaxGene血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.2 rs10876994和rs34536443位点基因分型 rs10876994、rs34536443位点引物序列设计和TaqMan MGB荧光探针序列设计均由美国应用生物系统公司(AB公司)完成。聚合酶链反应(PCR)的扩增反应在ABI 7900 PCR仪中进行，扩增程序为：(1)AmpliTaq Gold Enzyme活化95 ℃ 10 min；(2)PCR(60个循环)：变性92 ℃ 15 s，退火60 ℃ 60 s，延伸60 ℃ 60 s。反应完成后直接由ABI 7900扫描读取数据，产生结果并保存。对基因分型进行质量控制，随机抽取20例样本委托上海欧易生物医学科技有限公司采用ABI 3730基因测序仪对2个位点所在区域进行DNA直接测序，分析其基因型。

1.2.3 神经心理学评估 患者入院后每3 d评估一次长谷川痴呆量表(HDS)、常识-记忆-注意测验(IMCT)、日常生活能力量表(ADL)，直至治疗显效时为止[8]，3种智力量表取最差值。

2 结果

2.1 基因分型质量控制 荧光定量PCR基因型检测结果与测序结果符合率为99.25%。样本尺寸224能提供0.81的统计学效力，发现对基因型分布的微效影响(r=0.10～0.23)。rs34536443位点在研究群体内无多态性，在后续分析里剔除。

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析结果 rs10876994位点基因型分布在全部样本中符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=2.43,P=0.12)。

2.4 神经心理学分析 不同基因型患者ADL和IMCT评分比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同基因型患者HDS评分比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

表2 两组不同性别rs10876994位点基因型分布和等位基因频率比较〔n(%)〕

表1 两组rs10876994位点基因型分布和等位基因频率比较〔n(%)〕

表3 rs10876994位点不同基因型患者神经心理学的比较分)

注：HDS=长谷川痴呆量表，IMCT=常识-记忆-注意测验，ADL=日常生活能力量表；与AA携带者比较，*P<0.05；与AC携带者比较，△P<0.05

3 讨论

中枢神经系统脱髓鞘疾病是以脑和脊髓髓鞘破坏或脱失病变为主要特征的疾病，包括遗传性和获得性两大类。获得性中枢神经系统脱髓鞘疾病可分为继发于其他疾病的脱髓鞘病和原发性免疫介导的炎性脱髓鞘病。前者包括缺血缺氧性疾病(如DEACMP)、营养缺乏性疾病(亚急性联合变性)等，后者包括MS、视神经脊髓炎等。此类疾病发病多集中在自身免疫损伤和髓鞘结构破坏两大环节，且具有遗传易患性[9]。DEACMP属于典型的继发性脱髓鞘病，病理改变和临床表现与MS等疾病具有诸多相似性。目前认为DEACMP是由于缺血缺氧导致脑组织坏死和血-脑脊液屏障开放，激发严重免疫反应性髓鞘受损，导致在神经损伤和修复过程中出现的一系列神经和精神症状[2]。该病的发生与否及病情进展的程度与中毒程度、抢救措施、患者身体状况均有关。本课题组前期对豫北地区10年内405例DEACMP患者的发病情况进行了调查，年龄和中毒程度基本相同的74对ACMP夫妻患者中同时患DEACMP者仅有10对，且与中毒的严重程度无关。说明除年龄、中毒程度外还有其他因素影响DEACMP的发生，提示DEACMP患者在对ACMP后的解毒、免疫损伤、细胞凋亡等方面可能存在个体差异，推测个体遗传因素可能起到了重要的作用。

人TYK2基因是非受体型蛋白酪氨酸激酶，与Ⅰ型和Ⅱ型细胞因子受体结合，通过磷酸化受体的亚基放大信号，是免疫激活和抗病毒感染的重要角色[10]。白介素6、白介素12、一氧化氮合成酶(NOS)、干扰素等的激活均与其有关。有报道证实TYK2是MS的易患基因[5-7,11]，推测可能是该基因的变异改变了其表达产物的活性，对下游信号的传递和放大产生影响，与其他基因共同导致了疾病的发生。在对DEACMP患者外周血清的研究发现白介素6、白介素10和NOS均高于对照人群[3-4,12]，提示了DEACMP也可能有TYK2基因的参与。本研究比较了该基因的rs10876994和rs34536443位点在豫北汉族DEACMP组和ACMP组人群中的分布，发现两组间无差异。按性别分层后，两组间仍无差异。进一步的分析发现，rs10876994位点不同基因型携带者在病情最严重时的ADL和IMCT有差异，AA基因型携带者表现出了较轻的神经心理学缺陷，表现为保护因素。临床症状关联的研究结果在精神疾病研究中并不少见，林鄞等[13]最近就报道了G72 基因rs947267多态性与双相情感障碍患者的认知功能存在关联，但该位点与疾病的关联分析只得到了阴性结果。这些易患基因可能通过影响神经系统发育、神经递质传递功能等，在一定条件下引发神经发育障碍所致的认知和行为紊乱。临床症状的关联将有助于更细致地理解复杂性遗传疾病微效基因的易患机制。

本研究结果虽未证实TYK2基因与EDACMP的遗传关联，但神经心理学功能与本研究多态性位点的关联提示TYK2基因可能参与了该病的发生发展。未来应在动物实验中对TYK2基因在ACMP及DEACMP发生过程中的基因表达变化进行研究，在遗传水平上也应加大样本量，增加临床表型的采集和分析，最终阐明TYK2基因与DEACMP的关系。

1 叶任高,陆再英.内科学[M].6版.北京：人民卫生出版社，2004：971-974.

2 Song IU,Chung SW.Chorea as the first neurological symptom of delayed encephalopathy after carbon monoxide intoxication[J].Intern Med,2010,49(11):1037-1039.

3 郭艳平，杨清成，刘建敏.脑电图及事件相关电位对急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的预测价值研究[J].中国全科医学，2012，15(8)：2813.

4 甄龙,顾仁骏,张萍,等.急性一氧化碳中毒后迟发性脑病患者血清中白细胞介素水平及其临床意义[J].中华劳动卫生职业病杂志,2008,26(9):651-652.

5 顾仁骏,王夏红,张萍,等.急性一氧化碳中毒后迟发性脑病患者血清白细胞介素-6水平观察[J].中华劳动卫生职业病杂志,2005,23(6):461-462.

6 Bahlo M,Booth DR,Broadley SA,et al.Genome-wide association study identifies new multiple sclerosis susceptibility loci on chromosomes 12 and 20[J].Nat Genet,2009,41(7):824-828.

7 Mero IL,Lorentzen AR,Ban M,et al.A rare variant of the TYK2 gene is confirmed to be associated with multiple sclerosis[J].Eur J Hum Genet,2010,18(4):502-504.

8 顾仁骏,张子钦,孙世龙,等.影响急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的多因素分析[J].河南医科大学学报,1992,27(3):260-261.

9 宋秀娟,郭力,李彬,等.肿瘤坏死因子D基因多态性与多发性硬化的相关性研究[J].中国神经精神疾病杂志,2008,34(2):76-78.

10 Piganis RA,De Weerd NA,Gould JA,et al.Suppressor of cytokine signaling(SOCS) 1 inhibits type I interferon(IFN) signaling via the interferon alpha receptor(IFNAR1)-associated tyrosine kinase Tyk2[J].J Biol Chem,2011,286(39):33811-33818.

11 Dyment DA,Cader MZ,Chao MJ,et al.Exome sequencing identifies a novel multiple sclerosis susceptibility variant in the TYK2 gene[J].Neurology,2012,79(5):406-411.

12 孙伟力,王冀康,李时光,等.急性一氧化碳中毒后迟发性脑病患者血清NO与NOS 水平及其临床意义[J].中国神经精神疾病杂志,2011,37(9):523-526.

13 林鄞,曹莉萍,李烜,等.双相障碍Ⅰ型及认知功能与G72 基因rs947267多态性[J].中国心理卫生杂志,2011,25(4):295-301.