外源性一氧化碳对游离脂肪酸刺激巨噬细胞炎症反应的抑制作用

王金保，谢建新，王铁鹏，徐文静，冯晓朋，王婷婷，张 君

有研究表明，肥胖是一种慢性低炎症状态，各种炎性因子通过激活JNK1而导致各组织器官发生胰岛素抵抗[1]。在肥胖状态下，脂肪细胞释放过量饱和脂肪酸,通过TLR(toll-like receptor)4/NF-κB信号通路激活巨噬细胞；巨噬细胞分泌促炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α反作用于脂肪细胞，诱导炎症反应并促进游离脂肪酸(FFA)的进一步释放。高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织TLR1-9和TLR11-13表达升高，受体下游信号通路分子以及细胞因子〔TNF-α、白介素(IL)-6、干扰素(IFN)α/β、IL-12等〕的表达水平也有显著升高[2]。

研究发现，一氧化碳(CO)是一种细胞保护分子[3]。体内CO的来源有两种,一种是外源性CO,即吸入气体中含有的少量CO；另一种是内源性CO，机体内生成的CO。内源性CO主要来源于血红素氧合酶1(HO-1)催化血红素生成胆绿素、CO、Fe2+[4]的过程，正常情况下占75%。而一氧化碳释放分子2(CORM-2)是一种特殊的CO携带者，可作为外源性CO供体，在溶液中可以实现持续、缓慢释放CO的效果。最近研究提示CO/HO-1具有抗炎作用[5]，本研究利用巨噬细胞模型，研究CO抑制炎性反应的分子机制，探讨CO对肥胖状态炎性反应的作用，为临床代谢综合征的防治提供新的基础理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养及形态观察 RAW264.7巨噬细胞购于中国科学院上海细胞库。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养RAW264.7巨噬细胞，0.25%胰蛋白酶消化、传代，当细胞生长至培养瓶70%～80%时，显微镜下观察细胞形态并拍照，用于实验。

1.1.2 细胞分组及样本收集 取状态良好的巨噬细胞，分为空白对照组、FFA组和CORM-2组。空白对照组加无酚红无双抗的高糖DMEM培养基；FFA组将棕榈酸(PA)溶于100%异丙醇，加入无酚红无双抗的高糖DMEM培养基中,使FFA工作浓度为100 μmol/L，作用于巨噬细胞24 h；CORM-2组将CORM-2溶于DMSO中，加入无酚红无双抗的高糖DMEM使胰岛素工作浓度为100 μmol /L，作用于巨噬细胞24 h，收集细胞蛋白及上清-80 ℃保存。

1.2 研究方法

1.2.1 Western-blot法检测p-NF-κB的表达 取10 μl细胞总蛋白于10%SDS PAGE 凝胶中电泳，电转移至PVDF膜上。用含5% BSA的TBST封闭2 h后，膜浸入1∶1 000稀释的一抗工作液中，4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜30 min后加入1∶20 000稀释的二抗工作液，室温孵育2 h，TBST洗膜30 min后加入发光试剂溶液，暗室曝光，压X线片2～10 min，显影，定影。

1.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α和IL-6的表达 取细胞上清，严格按照说明书操作，用酶标仪450 nm检测各孔吸光度，采用ELISA分析软件和标准品结果，据各组的吸光度值计算TNF-α与IL-6水平。

2 结果

2.1 巨噬细胞形态 巨噬细胞呈圆形，少数细胞呈不规则形，分布均匀(见图1)。

2.2 p-NF-κB水平比较 Western-blot法结果显示，FFA组p-NF-κB表达水平明显高于空白对照组，CORM-2组p-NF-κB表达水平明显低于FFA组，差异有统计学意义(q=-27.631、20.083，P<0.05，见图2、表1)。

注：A为×200，B为×400

图1 RAW264.7巨噬细胞实验前形态

Figure1 The form prior to experiment of RAW264.7 macrophages

图2 Western blot结果显示的各组p-NF-κB表达水平

Figure2 Expression of p-NF-κB,protein detected by Western-blot

2.3 TNF-α与IL-6水平比较

2.3.1 TNF-α测定 FFA组TNF-α水平明显高于空白对照组，CORM-2组TNF-α水平明显低于FFA组，差异均有统计学意义(q=-14.05、10.926，P<0.05，见表1)。

2.3.2 IL-6测定 FFA组IL-6水平较空白对照组明显升高，CORM-2组IL-6水平较FFA组明显降低，差异有统计学意义(q=-17.151、12.235，P<0.05，见表1)。

表1 3组巨噬细胞p-NF-κB，TNF-α及IL-6表达水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与FFA组比较，△P<0.05;TNF-α=肿瘤坏死因子α，IL-6=白介素6

3 讨论

本研究结果提示，FFA刺激巨噬细胞后，p-NF-κB被激活，分泌的TNF-α及IL-6水平升高；而用CORM-2干预后这些指标的水平均明显下降，提示CORM-2对肥胖状态下FFA引起的巨噬细胞炎症有抑制作用。

在小鼠RAW264.7模型中，CO可以显著抑制由脂多糖(LPS)刺激的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(CM-CSF)产生；促进抗炎细胞因子IL-10产生，其机制可能是通过p38MAPK通路调节[6]。CO可通过阻止I-κΒα的磷酸化和降解抑制LPS诱导的NF-κB活性；CO还可抑制LPS诱导的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性，抑制TLR的膜转运，从而抑制配体诱导的活性氧的产生[7]。以上结果提示，CO对LPS引起的炎症有抑制作用。另外，Dancer等[8]观察到抑制基质金属蛋白酶(MMP)可以减轻肺纤维化程度，而CORM-2可以通过调节NF-κB途径调节MMP-2的释放。朱楠等[9]研究发现CORM可显著抑制肾脏固有树突状细胞表达TLR4，也可抑制LPS刺激和缺血损伤时炎症因子的表达，但对于TLR4缺陷小鼠这一抑制作用消失，提示CORM对内源性配体介导的固有树突状细胞活化过程的抑制作用由TLR4信号通路介导。最新的研究发现CORM具有抑制血小板聚集[10],抑制内皮细胞黏附分子表达[11]等作用。Tejero等[12]研究证实，动物接受低剂量(1/20的致死量)的CO可极大提高动物对高氧性损害的耐受性，HO-1/CO系统还可通过下调内皮细胞源性促炎递质包括细胞间黏附因子、血管细胞黏附因子、E-选择素等来抑制白细胞的黏附、聚集，拮抗炎症的发生及发展。

本实验用FFA干预巨噬细胞，模拟人体肥胖状态下的炎症状态，用CORM-2干预后，炎性蛋白p-NF-κB的表达明显降低，TNF-α及IL-6水平下降，验证了FFA可以引起巨噬细胞炎症，同时发现CORM-2对肥胖状态下的炎症有抑制作用，可能是通过抑制炎症信号通路NF-κB起作用，为CO改善肥胖状态下炎症引起的胰岛素抵抗和CO治疗糖尿病、代谢综合征提供了理论依据。

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