染料木黄酮的抗巨噬细胞泡沫化效应 及其分子机制研究

宋静岚，刘晨，赵颖，孟雅娟，路新华，赵宝华，郑智慧，段宝玲

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的主要病理基础，胆固醇、脂质代谢异常以及炎症的发生是 AS 的核心发病机制。在动脉粥样硬化的发生和发展过程中，大量泡沫化巨噬细胞的堆积形成动脉血管脂质条纹和脂质斑块，是 AS 病理学改变的关键环节[1]。泡沫化细胞形成的主要原 因是由于巨噬细胞的胆固醇摄入过多，而胆固醇逆向转运异常，从而造成细胞内胆固醇酯的过度聚积。因此，降低细胞内胆固醇含量，减少细胞中胆固醇酯的积蓄，从而减轻或抑制细胞的泡沫化，是防治 AS 的有效途径。

过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators activated receptors，PPARs）是一种核受体超家族成员。大量的研究已经证明 PPARs 参与体内糖平衡、脂质和脂蛋白代谢以及细胞分化过程，其激动剂具有胰岛素增敏、抗炎作用以及抑制动脉粥样硬化的发生和发展的重要调节作用[2-3]。肝 X 受体（liver X receptor，LXR）是一类在脂和胆固醇代谢中发挥重要作用的核受体[4]。在体内，LXR 作为胆固醇感受器，通过被氧胆固醇类物质[乳24(S),25-环氧化固醇、22(R)-羟基固醇和 24(S)-羟基固醇等]活化，对细胞内胆固醇水平变化作出应答，调控多种参与胆固醇的吸收、外流、转运和排泄等一系列基因的表达，从而调节胆固醇的代谢和平衡。

染料木黄酮（5,7,4'-三羟基异黄酮，genistein）又称染料木素、金雀异黄素，属于异黄酮类化合物，是大豆异常黄酮中的一种主要活性因子，是大豆异黄酮产品中最有效的功能成分。染料木黄酮已经被证明对人体具有调节血脂、降低胆固醇和防治动脉粥样硬化作用[5-6]，但染料木黄酮在动脉粥样硬化的发生早期事件中巨噬细胞泡沫化的作用以及其分子作用机制并没有明确的结论和阐释。为此，本研究对染料木黄酮的抗泡沫化效应及其分子机制进行了深入的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与质粒 中国仓鼠卵巢细胞 CHO- K1、小鼠巨噬细胞 RAW264.7 购自上海细胞生物学研究所。pGL3-GAL4、pGAL4-PPARα、pGAL4- PPARγ（LBD）、pGAL4-LXRα（LBD）、pGAL4-LXRβ、p3 × PPRE-Luc、pABCA1（promoter）-Luc、p4 × LXRE-Luc、pTARGET-PPARγ、pTARGET-LXRα 和 pTARGET-LXRβ 均由本实验室构建[7-8]。

1.1.2 主要试剂 Trizol RNA 提取试剂盒、SuperscriptTMReverse Transcription、脂质体 2000 购于美国 Invitrogen 公司；胎牛血清、PRMI 1640 培养基、无酚红 PRMI 1640 培养液为美国 Hyclone 公司产品；氧化的低密度脂蛋白 ox-LDL 购于北京协和医学院基础所；LPS 购于美国 Sigma 公司；阳性药 T0901317 为美国 Cayman 公司产品；染料木黄酮为华北制药集团新药公司产品，化学结构式见图 1。

图1 染料木黄酮的化学结构式 Figure 1 Chemical structure of genistein

1.1.3 主要仪器 GeneAmp PCR System 9600 为美国 Backman 公司产品；ABI 7000 Real time PCR 仪购自美国ABI 公司；CO2培养箱为美国科峻仪器公司产品；Victor2 多标计数仪为美国 PE 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞用含 10% 胎牛血清、 100 U/ml 青霉素和 100 mg/L 链霉素的 PRMI 1640 培养基，37 ℃，5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 油红 O 染色观察泡沫细胞 当 RAW264.7 细胞在 96 孔板中密度达到 90% 时，用无血清 PRMI 1640 培养液给细胞换液。加入终浓度为 50 μg/ml 的 ox-LDL 之后，分别用阳性药 T0901317 和染料木黄酮处理 48 h 后进行固定和油红O 染色，并在显微镜下观察和拍照。

1.2.3 瞬时转染和报告基因检测 具体方法参考文献[8-9]，即将待转染的细胞株以 3 × 104个/孔细胞数接种于 96 孔板，24 h 后将培养液换成含 10% 胎牛血清的无双抗的 PRMI 1640 培养基，用 脂质体 2000 转染试剂将 0.3 μg/孔报告质粒与 0.1 μg/孔表达质粒共转染入细胞中。6 h 后，加入测试样品，DMSO 作为空白对照。加药处理 24 h 后裂解细胞，利用 Victor2 多标计数仪检测荧光素酶的活性。药物对核受体激动活性以荧光素酶的表达诱导倍增数表示，其为加药组荧光素酶的活性与空白对照（DMSO）组的比值。半数有效浓度 EC50为最大效应一半时的药物浓度。

1.2.4 Real time PCR 检测胆固醇逆转运相关基因的表达 当 RAW264.7 细胞在 6 孔板中密度达到 90% 时，加入染料木黄酮处理 24 h 后，用 Trizol 法提取细胞总 RNA，并反转录成 cDNA。利用 ABI 7000 Real time PCR 仪以 GAPDH 基因为内参基因，对 LXRα、LXRβ、ABCA1、ABCG1、SR-B1、CD36 等胆固醇代谢相关基因的表达进行实时定量 PCR 分析。

根据 Real time PCR 引物设计原则，用 Primer Premier 5.0 软件设计引物，所有基因的引物见 表 1。Real time PCR 反应条件：①预变性：95 ℃，1 min；②两步法 PCR。变性：95 ℃，10 s；退火延伸：60 ℃，31 s；40 个循环。

表1 Real time PCR 所涉及的基因及其引物序列 Table 1 Genes and their primers used in Real time PCR

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 染料木黄酮对 ox-LDL 诱导 RAW264.7 巨噬细胞泡沫化的抑制效应

在小鼠 RAW264.7 细胞汇合度达到 90% 时加入终浓度为 50 μg/ml 的 ox-LDL，并且同时加入 20 μg/ml 染料木黄酮或等体积的 DMSO。48 h 后进行油红 O 染色，结果如图2 所示，空白对照（DMSO）组 ox-LDL 诱导巨噬细胞中出现大量 脂质堆积（图 2A），呈高泡沫化状态。相比之下，经过 20 μg/ml 染料木黄酮处理后（图2B）的 RAW264.7 细胞内均没有出现大量脂滴聚集的现象，细胞形态趋于正常，说明细胞的泡沫化被明显抑制。

图2 染料木黄酮对 RAW264.7 细胞泡沫化的抑制效应（A：DMSO 组；B：10 μg/ml 染料木黄酮处理组） Figure 2 Inhibitory effect of genistein on macrophase foam cell formation (A: DMSO group； B: 10 μg/ml genistein treatment group)

2.2 染料木黄酮对核受体PPAR 的转录激动活性

2.2.1 染料木黄酮对 PPAR 嵌合表达报告基因的转录诱导活性 将 pGL3-GAL4 报告质粒分别与 pGAL4-PPARα（LBD）或 pGAL4-PPARγ（LBD）表达质粒共转染，6 h 后加入 0.1 ～ 50 μg/ml 不同浓度的染料木黄酮，孵育 24 h 后，进行报告基因荧光素酶活性的检测。结果见图 3，从图中可以看出染料木黄酮能剂量依赖地诱导 PPARα 和 PPARγ 调控的荧光素酶的表达，其 EC50分别为 5.2 μg/ml 和 9.2 μg/ml。

2.2.2 染料木黄酮对 PPRE-Luc 报告基因的转录诱导活性 为了证实染料木黄酮对 PPAR 的转录激动活性，进一步利用 3 × PPRE-Luc 报告基因方法检测染料木黄酮对 PPAR 转录激动活性。将报告质粒 p3 × PPRE-Luc 和 PPARγ 全长的表达质粒 pTarget-PPARγ 共转染 CHO-K1 细胞，结果如图 4 所示，染料木黄酮能剂量依赖地诱导报告基因荧光素酶的表达，其 EC50为 3.5 μg/ml。该结果与嵌合表达受体报告基因方法的结果一致，进一步证实了 染料木黄酮对 PPAR 的转录激动作用。

图3 染料木黄酮对嵌合表达 PPARα（A）和 PPARγ（B）的转录诱导活性 Figure 3 Induction efficiency of genistein on the transactivion of PPAR in PPARα (A) and PPARγ (B) chimeric receptor assay

图4 染料木黄酮对 PPRE-Luc 报告基因的转录诱导活性 Figure 4 Induction efficiency of genistein on the transactivion of PPAR in PPRE-Luc receptor assay

2.3 染料木黄酮对 LXR 的转录诱导活性

2.3.1 染料木黄酮对 LXR 嵌合受体报告基因的转录诱导活性 将 pGL3-GAL4 与 pBIND-LXRα（LBD）或 pBIND-LXRβ（LBD）共转染 CHO-K1 细胞，6 h 后加入 0.1 ～ 50 μg/ml 7 个不同浓度的染料木黄酮，并孵育 24 h。结果见图 5，染料木黄酮上调 LXRα 和 LXRβ 调控的荧光酶的表达成剂量 依赖关系，其 EC50分别为 1.6 μg/ml 和 3.3 μg/ml。

图5 染料木黄酮对 LXRα（A）和 LXRβ（B）嵌合受体报告基因的转录诱导活性 Figure 5 Induction efficiency of genistein on transactivion of LXR in LXRα (A) and LXRβ (B) chimeric receptor assay

2.3.2 染料木黄酮对 ABCA1-promoter-Luc 报告基因的转录诱导活性 ABCA1 是 LXR 的一个重要靶基因，其启动子序列中具有 LXR 的相应元件 LXRE。为了进一步证明染料木黄酮对 LXR 靶基因的转录激动效应，检测了其对 ABCA1-promoter- Luc 报告基因的诱导活性。共转染报告质粒 pGL3-ABCA1（promoter）-Luc 和全长 LXR 表达质粒 pTARGET-LXR，加入 0.1 ～ 50 μg/ml 不同浓度的染料木黄酮 24 h 后，检测荧光素酶的活性，结果如图 6 所示，染料木黄酮能有效地诱导 ABCA1 启动子调控下的报告基因荧光素酶的表达，其 EC50约为 2.67 μg/ml。

2.3.3 染料木黄酮对 LXRE-Luc 报告基因的转录诱导活性 LXRE-Luc 报告基因是一种被广泛应用于 LXR 调节剂转录激动活性测定的报告 基因方法。为了确认染料木黄酮对 LXR 的转录 激动作用，本研究进一步检测了染料木黄酮对 LXRE-Luc 报告基因的转录激动活性。共转染报告质粒 p4 × LXRE-Luc 和 LXR 全长表达质粒 pTARGET-LXR，6 h 后加入不同浓度的染料木黄酮。结果如图 7 所示，报告基因荧光素酶的活性随着染料木黄酮浓度的提高而剂量依赖地增加，EC50值为 2.8 μg/ml。

图6 染料木黄酮对 ABCA1（promoter）-Luc 报告基因的转录诱导活性 Figure 6 Induction efficiency of genistein on the transactivion of LXR in ABCA1(promoter)-Luc assay

2.4 染料木黄酮对巨噬细胞泡沫化相关基因表达的影响

为了研究染料木黄酮对巨噬细胞中与泡沫化密切相关基因的表达变化，利用实时定量 PCR 对 LXRα、LXRβ 以及巨噬细胞胆固醇转运基因 ABCA1、ABCG1、CD36、SR-B1 等 6 个基因进行了 mRNA 水平的变化分析。结果如图 8 所示，相对于空白对照，经染料木黄酮处理后的细胞中 ABCA1、ABCG1、LXRα、LXRβ、SR-B1 在 mRNA 水平的表达量被分别上调了（2.63 ± 0.18）、（15.9 ± 1.1）、（5.5 ± 0.23）、（5.9 ± 0.22）、（3.36 ± 0.15）倍，而 CD36 在 mRNA 水平的表达量下降为对照组的（0.79 ± 0.13）倍。

图7 染料木黄酮对 LXRE-Luc 报告基因的转录诱导活性 Figure 7 Induction efficiency of genistein on the transactivion of LXR in LXRE-Luc receptor assay

图8 实时定量 PCR 分析染料木素对 RAW264.7 细胞中胆固醇转运相关基因 LXRα、LXRβ、ABCA1、ABCG1、SR-B1 和 CD36 基因表达的影响 Figure 8 The relative mRNA levels of LXRα, LXRβ, ABCA1, ABCG1, SR-B1 and CD36 in RAW264.7 cells responsed to genistein

3 讨论

动脉粥样硬化（AS）是一个复杂的病理过程。泡沫细胞形成是动脉粥样硬化形成的早期事件。在血管内皮发生损伤的情况下，血液中的单核细胞通过内皮间隙进入血管内皮内膜，并增殖、分化为巨噬细胞。低密度脂蛋白渗入血管内皮下并发生氧化修饰，形成氧化型低密度脂蛋白胆固醇，并主要通过巨噬细胞膜表面的 A 型清道受体吞噬大量氧化型低密度脂蛋白，导致细胞内脂质的大量堆积，形成泡沫细胞。越来越多的泡沫细胞堆积在一起形成脂质条纹乃至脂质斑块。所以，巨噬细胞的泡沫化是动脉粥样硬化形成的关键环节，而对巨噬细胞泡沫化过程的干预，可以起到防治 AS 的效果[1]。

巨噬细胞中有多种基因调控着细胞内胆固醇的稳态，其中主要包括清道夫受体和胆固醇转运蛋白，如 ATP 结合盒转运蛋白（ABCA1 和 ABCG1）和清道夫受体 B1（scavenger receptor B1，SR-B1）、CD36[1]。ABCA1 和 ABCG1 是巨噬细胞内参与胆固醇外流信号通路的两个关键基因，可介导胆固醇通过载脂蛋白 A-I（apoA-I）的活跃外流[9]。ABCA1/ ABCG1 表达的下调将导致细胞内胆固醇酯蓄积和泡沫细胞的形成[10]。CD36 属于 B 族清道夫受体家族成员之一，是巨噬细胞表面识别和内吞氧化 LDL，从而导致动脉粥样硬化巨噬细胞泡沫化的主要受体[11]。CD36 敲除能显著降低小鼠腹膜巨噬细胞对 ox-LDL 的结合和摄取能力显著降低以及动脉损伤程度[12]。SR-B1 是 B 族清道夫受体家族成员之一，是脂蛋白受体中唯一能真正介导细胞与 HDL-c 作用的膜受体。CLA1/ SR-B1 通过与 HDL 高亲和力结合，促进胆固醇从泡沫细胞外流，是重要的抗动脉粥样硬化受体[13]。

大量的研究已经证实 PPARγ 直接参与巨噬细胞内胆固醇和脂质的平衡，进而影响 AS 的进程。PPAR 是调剂 CD36 表达的关键因子，PPARγ 的配体 15-脱氧前列腺素 J2（15d-PGJ2）和噻唑烷二酮类抗糖尿病药物均能上调 CD36 的表达，但由于 PPAR 同时对其他抗动脉粥样硬化基因表达的调控，从而对抗了 CD36 表达上调带来的影响[14]。PPAR 的激动可以上调肝 X 受体（LXR）的转录，而 LXR 的活化则诱导 ABCA1、ABCG1、ABCG8 以及 SR-B1 等靶基因的转录，从而促进巨噬细胞胆固醇的逆向转运，抑制巨噬细胞的泡沫化[14-15]。

本研究在体外 ox-LDL 诱导小鼠单核巨噬细胞 RAW264.7 泡沫化实验结果证明了染料木黄酮能有效地抑制巨噬细胞的泡沫化。多种报告基因方法证实染料木黄酮可以有效地激活 PPAR 和 LXR 转录功能，是一种 PPAR 和 LXR 双效激动剂。这说明染料木黄酮是通过影响核受体 PPAR 和 LXR 的功能从而调节了胆固醇的转运。进一步的定量 PCR 结果说明染料木黄酮能够明显上调 RAW264.7 巨噬细胞中胆固醇逆转运基因 LXR、ABCA1、ABCG1 和SR-B1 的表达，增加细胞中胆固醇的外排，最终降低巨噬细胞中氧化胆固醇的含量，从而抑制巨噬细胞的泡沫化现象，该结果与Yang 等[16]研究黄酮类化合物可以上调 CLA1/SR-B1 基因表达相一致。定量 PCR 的结果也显示染料木黄酮对 CD36 基因的表达调控无明显调节作用。该结果与 PPAR 激动剂可以诱导 CD36 表达的实验不相一致[13]，其可能的原因是染料木黄酮同时激活了 LXR 或其他基因，从而对抗了 PPAR 对 CD36 的上调效应。

总之，本研究的实验证实了染料木黄酮对动脉粥样硬化中巨噬细胞泡沫化具有有效的抑制作用，而且该作用是由于染料木黄酮作为 PPAR 和LXR 双激动剂，通过激活核受体 PPAR 和 LXR 转录调控途径，从而诱导 ATP 结合盒 A1（ABCA1）、G1（ABCG1）和SR-B1 的表达，促进巨噬细胞胆固醇流出，减少细胞内脂质的蓄积，抑制泡沫化细胞形成。

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