人钠/碘转运体基因转染结肠癌SW480细胞及相关蛋白表达的检测

周佰林 张琦 张红征 李焕斌 文正伟 王玲

人钠/碘转运体基因转染结肠癌SW480细胞及相关蛋白表达的检测

周佰林 张琦 张红征 李焕斌 文正伟 王玲

目的以重组人钠/碘转运体（hNIS）基因转染结肠癌SW480细胞并检测hNIS mRNA及蛋白的表达，为放射性碘治疗非甲状腺肿瘤提供新思路。方法将构建好的重组质粒（pcDNA3.1+-hNIS）进行酶切、测序鉴定并扩增、提取。SW480细胞分为重组质粒（pcDNA3.1+-hNIS）转染组、空白质粒（pcDNA3.1+）转染组、空白对照组，转染后以RT-PCR和Western blot检测各组细胞hNIS mRNA和蛋白的表达。结果酶切和测序结果显示插入的hNIS基因大小和方向均正确。RT-PCR和Western blot显示重组质粒转染组SW480细胞可见hNIS mRNA和蛋白的表达，而空白对照组和空白质粒转染组均未检测到hNIS mRNA和蛋白的表达。结论脂质体法可有效地将hNIS基因转染至SW480细胞并成功表达hNIS蛋白。

钠/碘转运体 蛋白免疫印迹 基因转染 脂质体

【 Abstract】 ObjectiveTo transfect human sodium/iodide symporter gene hNIS into colon cancer SW480 cells and to examine the hNIS mRNA and protein expression.MethodsThe recombinant plasmid(pcDNA3.1+-hNIS)was constructed,identified and transfected into SW480 cells with lipofectamine 2000.Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)and Western blot were applied to detect the hNIS mRNA and protein expression.ResultsEnzyme digestion and DNA sequencing confirmed the size and direction of the recombinant(pcDNA3.1+-hNIS)plasmid.RT-PCR and Western blot showed the expression of hNIS mRNA and protein in pcDNA3.1+-hNIS-transfected SW480 cells,not in non-transfected cells or blank plasmid-transfected cells.ConclusionThe hNIS gene is effectively transfected into human colon cancer SW480 cells and the NIS protein is expressed successfully.

钠/碘转运体（sodium/iodide symporter，NIS）是甲状腺滤泡细胞基底膜外侧的一个镶嵌蛋白，也是甲状腺激素生物合成、核素显像及放射性碘治疗的基础。131Ⅰ为放射性核素，其衰变过程中可发射β射线从而起到抑制、杀伤或杀死肿瘤细胞的作用，NIS则具有浓聚131Ⅰ的功能。由于一些甲状腺癌丧失聚碘功能以及一些非甲状腺肿瘤无聚碘功能，使放射性碘治疗难以发挥作用。本研究利用脂质体法转染hNIS基因到结肠癌SW480细胞，并通过RT-PCR和Western blot检测细胞内hNIS mRNA和蛋白的表达，以期为放射性碘治疗非甲状腺肿瘤提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 结肠癌SW480细胞由温州医学院附属第二医院中医科惠赠，质粒pcDNA3.1+由复旦大学惠赠，pcDNA3.1+-hNIS重组质粒由本实验室合成，BamH I/ EcoR I、MiniBEST Plasmid Purification Kit购自大连宝生物公司，LipofectamineTM2000购自invitrogen公司，hNIS蛋白一抗购自Abcam公司，内参β-actin一抗以及相关二抗购自Santa cruz公司，hNIS和β-actin上下游引物及测序引物等由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 SW480细胞以1640培养基培养，长满培养瓶85%～90%时传代。将细胞分为重组质粒（pcDNA3.1+-hNIS）转染组、空白质粒（pcDNA3.1+）转染组和空白对照组。

1.2.2 重组质粒酶切和测序 取pcDNA3.1+-hNIS 5μl、10×缓冲液5μl、BamHⅠ1.5μl、EcoRⅠ1.5μl、以ddH2O加到总体积50 μl，37℃反应2h，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳。测序由大连宝生物公司完成，测序完成后整合4次测序结果得出插入基因序列。

1.2.3 扩增提取重组质粒 （1）配置LB培养基100ml，加入琼脂高温高压灭菌，摇匀；加入氨苄青霉素60μl（50mg/ml）混匀；将培养基倒入玻璃平板培养皿，凝固后倒置紫外杀菌30min；大肠杆菌接种到培养基上37℃过夜；第2天挑取单菌落接种到添加了氨苄青霉素的LB培养基5ml玻璃试管中，37℃，200r/min摇床过夜培养。（2）采用传统SDS碱裂解法提取高纯度质粒DNA并测定OD260和OD280。

1.2.4 重组质粒转染SW480细胞 制备DNA-LipofectamineTM2000混合物：将5μl脂质体加入245μl无血清1640培养基；再将5μg重组质粒加入245μl无血清培养基，室温放置5min后，将稀释的质粒和LipofectamineTM2000混匀室温放置20min，形成DNA-LipofectamineTM2 000混合物。将其加入6孔板细胞中，培养6h后换有血清培养基继续培养48h。

1.2.5 RT-PCR检测hNIS mRNA表达 异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA，计算RNA含量和纯度。hNIS上游引物：5′GACTGATGTGTTCCAGGTCGT3′，下游引物：5′GGGTCGCAGTCAGTGTAGAAC3′；内参βactin上游引物：5′CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT3′，下游引物：5′GGAGCAATGATCTTGATCTT3′。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火（hNIS 59℃、βactin 72℃）30s，72℃延伸30s，31个循环再72℃延伸10min。反应产物行琼脂糖凝胶电泳。

1.2.6 Western blot检测hNIS蛋白表达 收集各组细胞后提取蛋白，上样检测，化学发光试剂显色，ECL法暗室曝光。

2 结果

2.1 酶切以及测序结果 对重组质粒进行BamH I/ EcoR I双酶切，结果显示在1 944bp和5 405bp左右有两条清晰的条带,与理论计算结果相符合，见图1。测序结果显示整个核苷酸序列包括起始密码子ATG到终止密码子TGA的643个氨基酸和NCBI序列CDS区序列相同（NM_000453），基因大小和方向也正确。

2.2 扩增提取重组质粒琼脂糖凝胶电泳结果 以Beyotime DNA Ladder为核酸分子量标准，结果显示在7 000bp左右有1条清晰条带，可以证实本次质粒提取成功，见图2。

图1 重组质粒pcDNA3.1+-hNIS BamH I/EcoR I双酶切琼脂糖凝胶电泳图（M1:λ-Hind III酶切；1：pcDNA3.1+DNA；2：pcDNA3.1+-hNIS-BamH I/EcoR I；3：hNIS DNA；M2：DNA Marker）

图2 重组质粒提取琼脂糖凝胶电泳图

2.3 扩增提取重组质粒BamH I/EcoR I双酶切检测酶切后琼脂糖凝胶电泳结果显示在1 944bp和5 405bp有两条清晰的条带与理论计算结果相符合，可以证实本次质粒为pcDNA3.1+-hNIS，见图3。

图3 扩增提取重组质粒BamHI/EcoR I双酶切琼脂糖凝胶电泳图

2.4 RT-PCR检测细胞hNIS mRNA表达 重组质粒转染组可见扩增的369bp大小条带，而在空白质粒转染组和空白对照组均未检测到hNIS mRNA的表达，见图4。2.5 Western blot检测细胞hNIS蛋白表达 Western blot显示在重组质粒转染组SW480细胞可见69KD大小条带，而在空白质粒转染组和空白对照组均未检测到hNIS蛋白的表达，见图5。

图4 RT-PCR检测细胞hNIS mRNA表达（1：空白质粒转染组；2：重组质粒转染组；3：空白对照组）

图5 Western blot检测细胞hNIS蛋白表达（1：空白对照组；2：重组质粒转染组；3：空白质粒转染组）

3 讨论

近年来，随着对肿瘤发病机制认识的不断深入，尤其是DNA重组和基因转移技术逐步成熟，基因治疗肿瘤成国内外研究热门。利用基因转移技术导入目的基因，改变细胞的生物学特性，或者将与肿瘤的发生、发展相关的变异基因加以校正或修复以治疗肿瘤已有较多研究。

口服131Ⅰ治疗分化型甲状腺癌疗效显著[1-3]，因甲状腺滤泡细胞表达NIS蛋白,介导病灶细胞中131Ⅰ逆浓度梯度的主动转运，使病灶浓聚131Ⅰ，利用131Ⅰ的β射线发挥治疗作用。Smanik[4]等从人甲状腺cDNA文库中分离出hNIS基因,利用其转染非甲状腺肿瘤细胞，使放射性核素治疗成为可能。已有Smit等[5]和Shimura等[6]的研究说明hNIS转基因技术在摄碘率低下的甲状腺癌中进行放射性碘治疗的可行性。同时有更多的研究[7-8]将hNIS转染非甲状腺肿瘤细胞使其表达NIS蛋白，从而对放射性碘的摄取和贮存增加，达到杀伤肿瘤细胞的目的。许多学者[9-13]进行了不同方法转导NIS基因介导细胞碘摄取的体内外研究，Yan等[14]亦利用脂质体LipofectamineTM2 000为载体，成功将hNIS基因转染至人非小细胞肺癌细胞株A549。周泉波等[15]利用重组pDC316-MCMV/hNIS真核表达质粒将hNIS基因转染胰腺癌细胞株CAPAN-Ⅱ细胞、PANC-1细胞和卵巢癌细胞株SK-OV-3细胞。以上研究为转染hNIS到非甲状腺肿瘤，实现放射性碘治疗提供了有力的实验证据。

本实验中pcDNA3.1+-hNIS重组质粒基因测序结果与文献报道一致[16]，BamH I/EcoR I双酶切结果显示重组质粒在1 944bp和5 405bp左右有两清晰电泳条带，与理论计算结果相符，证实重组质粒pcDNA3.1+-hNIS中成功插入了hNIS序列。脂质体法转染SW480细胞后，重组质粒转染组细胞可见hNIS mRNA和蛋白表达，而在空白质粒转染组和空白对照组均未检测到hNIS mRNA和蛋白的表达。本实验结果说明转染SW480细胞成功，可为下一步进行放射性碘治疗作初步准备。

尽管NIS的研究已经取得了长足进步，但NIS的靶向作用、表达程度、在肿瘤细胞中的分布等一系列问题还要进一步探索。目前转染的载体是质粒、病毒或非病毒载体,所使用的启动子一般都是巨细胞病毒启动子，启动效率高，但特异性差，在所有细胞中都可以高效的表达外源基因。目前的研究表明碘在转染NIS基因的非甲状腺肿瘤细胞内滞留时间过短，可能与碘被摄取后未能进一步实现有机化而迅速流失有关。如何提高放射性碘对肿瘤组织的靶向性，以及延长碘在细胞内的滞留时间等方面还需要更深入的研究。

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Expression of human sodium/iodide symporter protein in hNIS-transfected colon cancer SW480 cells

Sodium/iodide symporterWestern blotGene transfection Liposome

2012-04-19）

（本文编辑：胥昀）

温州市科技局科研基金资助项目（Y20090094）

325027 温州医学院核医学教研室

张琦，E-mail:wzzhangqi@126.com