新诊断2型糖尿病患者血清高迁移率族蛋白1和Toll样受体4水平变化及其与胰岛素抵抗的关系研究

潘佳秋，徐微微，张 超

2型糖尿病(T2DM)发病的两个基本环节是胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足，其中胰岛素抵抗贯穿了糖尿病发生、发展的全过程，炎性因子在此过程起到了不可忽视的作用。研究证实，细胞炎性因子在胰岛素抵抗及心血管疾病中发挥重要作用，被认为是胰岛素抵抗及心血管疾病的中心环节。此外，细胞炎性因子可以促进胰岛素抵抗、糖耐量受损、糖尿病的发生和发展，而纠正血浆细胞炎性因子水平可以逆转这一过程[1]。高迁移率族蛋白1(high mobility group box protein-1，HMGB1)和Toll样受体4(Toll-like receptors 4，TLR4)是细胞炎性因子，可能参与T2DM的发生、发展。目前有关这两种炎性细胞因子之间的相互关系及二者在T2DM患者胰岛素抵抗发生中的作用研究不多，故本研究对此进行初步探讨。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2011年6—11月在我院内分泌科就诊的新诊断T2DM患者60例(T2DM组)，病程均<1年，平均病程为2.0个月；均符合1999年世界卫生组织(WHO)T2DM诊断标准，且起病年龄>25岁，入组前未使用降糖、降脂药物治疗。另选取同期在我院体检的30例健康者(血糖在3.9～6.0 mmol/L)为对照组(NC组)，均无明显心、脑、肝、肾、肺等重症疾病，无恶性肿瘤，无急慢性感染，未使用过激素类药物。T2DM组中，男32例，女28例；平均年龄(43.8±9.1)岁。NC组中，男17例，女13例；平均年龄(42.0±9.1)岁。两组受检者的性别构成及年龄间有均衡性。

1.2方法

1.2.1临床资料收集所有受检者禁食10 h后于次日清晨空腹采集肘静脉血5 ml，离心分离血清，测定空腹血糖(FPG)、血脂、肝功能、胰岛素等；另取一份血离心后存入-40 ℃冰箱，用于血清HMGB1和TLR4测定。同时测量身高、体质量，并计算体质指数(BMI)。

1.2.2检测方法FPG、血脂、肝功能等采用日本OLYMPUS公司AU-2700全自动生化分析仪酶法进行检测；空腹胰岛素(FINS)用电化学发光免疫法测定，采用德国罗氏全自动电化学发光法检测(试剂盒购于德国罗氏公司，批内CV<2.0%，批间CV<2.5%)；采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定空腹血清HMGB1和TLR4水平(试剂盒为美国R&D公司生产，由上海沪尚生物科技有限公司提供；HMGB1：批内CV<9%，批间CV<15%；TLR4：批内CV<9%，批间CV<15%)。

计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5；胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)=FINS×20/FPG-3.5；胰岛素敏感性指数(ISI)采用定量胰岛素敏感性检测指数(QUICKI)，公式为ISI=1/〔log(I0)+log(G0)〕，I0为FPG，G0为FINS。各公式中FPG单位均为mmol/L，FINS单位为mU/L。

2　结果

2.1两组临床资料比较T2DM组和NC组受检者的BMI、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、FPG、FINS、HOMA-IR、ISI、HOMA-β、HMGB1、TLR4比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；而两组天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、C肽水平间差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.2HMGB1、TLR4与其他观察指标Spearman相关分析结果结果显示，血清HMGB1与BMI、TG、FPG、HOMA-IR、TLR4呈正相关，而与HOMA-β、ISI呈负相关(P<0.05)；血清TLR4与BMI、TG、FPG、HOMA-IR、HMGB1呈正相关，而与HOMA-β、ISI呈负相关(P<0.05，见表2)。

2.3多元逐步回归分析以HMGB1为应变量，BMI、TG、TC、FPG、HOMA-IR、ISI、HOMA-β、TLR4为自变量，进行多元逐步回归分析，最后仅TLR4进入回归方程(β=0.281，P=0.000)，常数项为零。

以TLR4为应变量，BMI、TG、TC、FPG、HOMA-IR、ISI、HOMA-β、HMGB1为自变量，进行多元逐步回归分析，最后HMGB1、HOMA-β、ISI进入回归方程(β值分别为-4.146、-4.325和-5.061；P<0.05)，常数项为零。

表1　T2DM 组与NC组各项观察指标比较

注：BMI=体质指数，AST=天冬氨酸氨基转移酶，ALT=丙氨酸氨基转移酶，ALP =碱性磷酸酶，TG=三酰甘油，TC=总胆固醇，FPG=空腹血糖，FINS=空腹胰岛素，HOMA-IR=胰岛素抵抗指数，ISI=胰岛素敏感性指数，HOMA-β=胰岛β细胞功能指数，HMGB1=高迁移率族蛋白1，TLR4=Toll样受体4

表2　HMGB1、TLR4与其他观察指标的Spearman相关分析结果

注：-表示无数据

3　讨论

HMGB1是一种高度保守的DNA结合蛋白，由坏死细胞、受到胆固醇刺激的血管平滑肌细胞以及氧化应激状态下的巨噬细胞等释放，其有着多种细胞外功能，如促细胞分化、激活并调节炎症等[2]。HMGB1能够释放肿瘤坏死因子(TNF)、白介素8(IL-8)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、血浆纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)[3]，HMGB1也有破坏内皮细胞膜屏障作用[4]。这些说明HMGB1在感染和组织损伤的过程中促进血管内皮细胞的炎症反应。HMGB1是一种血管平滑肌细胞趋化剂，可以导致血管平滑肌细胞由外膜向内膜迁移，能够引起动脉粥样硬化和血管狭窄[5-6]。研究证明，在糖尿病视网膜病变活动期的玻璃体样本内HMGB1水平是非活动期的2倍，是非糖尿病患者的3倍[7]。本研究结果显示，新诊断T2DM患者血清HMGB1水平显著升高，考虑其炎症作用及对血管内皮的影响在T2DM初期已经开始。此过程可能是HMGB1通过晚期糖化终产物(RAGE)受体信号，并通过Toll样受体2(TLR2)和TLR4激活核因子κB(NF-κB)，诱导激活白细胞黏附分子的上调和产生炎性细胞因子，促进炎症并推动疾病进程，此过程可能参与了糖尿病的发生及胰岛素抵抗产生。

TLR4是在哺乳动物体内发现最早的TLR家族成员，参与炎症、免疫细胞的成熟分化和免疫应答，其信号途径能够使血管平滑肌转化成促炎表型，导致血管平滑肌细胞释放趋化因子和促炎细胞因子。试验证明，游离脂肪酸是胰岛素抵抗的重要原因，高水平的游离脂肪酸转导引起细胞内炎症信号产生，其可以利用先天免疫受体TLR4诱导巨噬细胞、脂肪细胞及肝脏表达炎症因子。本研究结果显示，新诊断T2DM患者血清TLR4水平显著升高。TLR4信号的出现需要以下因素：脂肪细胞内游离脂肪酸诱导的胰岛素抵抗，高脂饮食以及脂质输液[8]。Tsukumo等[9]研究显示，基因工程小鼠(基因突变导致TLR4功能受损)能够对抗饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗的发展。Reyna等[10]发现肥胖和2型糖尿患者肌肉中TLR4基因表达及蛋白质含量显著升高，这与胰岛素抵抗的严重程度密切相关。

本研究发现HMGB1、TLR4与BMI、TG、FPG、HOMA-IR、TLR4呈正相关，与HOMA-β、ISI呈负相关。可能是HMGB1及TLR4影响胰岛素的信号转导，产生炎性反应，降低了靶组织细胞的胰岛素受体数量，抑制胰岛素与受体的结合，引起胰岛素抵抗。有研究证明，与健康人比较，在T2DM患者的单核细胞中TLR2、TLR4的mRNA和蛋白显著增加[11]。通过本实验可以得出TLR4在新诊断的T2DM患者血清中表达较正常组明显增加，推测其可能与血糖升高、HOMA-IR等相关。TLR4在胰岛素抵抗和糖尿病的发生发展中可能发挥着重要作用，但TLR4的确切生理功能目前尚不十分明确，关于它在人类胰岛素抵抗相关疾病发生中的作用报道也较少，尚需进一步研究。

1阴奇男.细胞炎性因子与胰岛素抵抗及2型糖尿病的相关关系[J].中外医疗，2010，29(1)：35.

2Lotze MT，Tracey KJ.High-mobility group box1 protein(HMGB1)：nuclear weapon in the immune arsenal[J].Nat Rev Immunol，2005，5(4)：331-342.

3Fiuza C，Bustin M，Talwar S，et al.Inflammation-promoting activity of HMGB1 on human microvascular endothelial cells[J].Blood，2003，101(7)：2652-2660.

4Palumbo R，Sampaolesi M，Marchis FD，et al.Extracellular HMGB1，a signal of tissue damage，induces mesoangioblast migration and proliferation[J].J Cell Biol，2004，164(3)：441-449.

5Degryse B，Bonaldi T，Scaffidi P，et al.The high mobility group(HMG) boxes of the nuclear protein HMG1 induce chemotaxis and cytoskeleton reorganization in rat smooth muscle cells[J].J Cell Biol，2001，152(6)：1197-1206.

6Degryse B，de Virgilio M.The nuclear protein HMGB1，a new kind of chemokine?[J].FEBS Lett，2003，553(1/2)：11-17.

7El-Asrar AM，Nawaz MI，Kangave D，et al.High-mobility group box-1 and biomarkers of inflammation in the vitreous from patients with proliferative diabetic retinopathy[J].Mol Vis，2011，17：1829-1838.

8Shi H，Kokoeva MV，Inouye K，et al.TLR4 links innate immunity and fatty acid-induced insulin resistance[J].J Clin Invest，2006，116(11)：3015-3025.

9Tsukumo DM，Carvalho-Filho MA，Carvalheira JB，et al.Loss-of-function mutation in Toll-like receptor 4 prevents diet-induced obesity and insulin resistance[J].Diabetes，2007，56(8)：1986-1998.

10Reyna SM，Ghosh S，Tantiwong P，et al.Elevated toll-like receptor 4 expression and signaling in muscle from insulin-resistant subjects[J].Diabetes，2008，57(10)：2595-2602.

11Dasu MR，Devaraj S，Park S，et al.Increased toll-like receptor(TLR) activation and TLR ligands in recently diagnosed type 2 diabetic subjects[J].Diabetes Care，2010，33(4)：861-868.