2型糖尿病肾病患者血管生成素2 A1087G基因多态性的研究

何 泉，罗海明，朱宝生，唐新华，蒋绿芝

血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2)是新发现的分泌性内皮细胞特异性糖蛋白生长因子，与血管内皮生长因子(VEGF)一样是血管内皮家族中的成员。分子量约为70 kD，基因定位于染色体的8p23，cDNA编码496个氨基酸，在血管内皮中表达。糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一，DN发生、发展的确切机制不明，目前研究认为与糖代谢紊乱、血流动力学改变、细胞因子、遗传背景等多种因素综合作用有关。近来Anuradha等[1]研究发现Ang-2在2型糖尿病(T2DM)、糖耐量异常(IGT)以及无空腹血糖升高的代谢综合征患者中高表达，导致血清Ang-2水平升高。本研究通过比较T2DM患者、DN患者及健康者Ang-2 A1087G的基因频率和等位基因频率以及血清Ang-2水平，从而探讨Ang-2 A1087G基因多态性与T2DM肾病的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2010年1月—2012年1月云南省第一人民医院、昆明医科大学第二附属医院内分泌科收治的T2DM患者1 021例(T2DM组)，均符合1999年世界卫生组织(WHO)糖尿病诊断标准，且排除心力衰竭、慢性肾小球疾病、肾盂肾炎、慢性肾衰竭等DN以外的肾脏疾病及糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷，排除治疗期间使用排泄药物者。T2DM组中男506例，女515例；平均年龄(58.5±9.4)岁。另选取同期在同一医院体检无糖尿病、肾病家族史及肾功能正常的健康者254例(NC组)，其中男119例，女135例；平均年龄(46.7±8.9)岁。两组受检者均为昆明地区无血缘关系的汉族人。

根据T2DM组患者尿清蛋白排泄率(unrinal albuminuric excretion rate，UAER)，进一步将T2DM患者分为3组：(1)T2DM无DN组(DN0组，431例)：2次测定UAER<30 mg/24 h，病程至少5年以上。其中男199例，女232例；平均年龄(59.7±10.4)岁。(2)T2DM合并微量蛋白尿组(DN1组，322例)：2次测定30 mg/24 h≤UAER<300 mg/24 h。其中男155例，女167例；平均年龄(61.7±11.9)岁。(3)T2DM合并大量蛋白尿组(DN2组，268例)：2次测定UAER≥300 mg/24 h；其中男119例，女149例；平均年龄(62.7±12.5)岁。NC组、DN0组、DN1组、DN2组受检者性别构成及平均年龄间有均衡性。

1.2 主要实验试剂和仪器 DNA提取试剂盒(Omega，USA)，PCR反应引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕；Taq酶、dNTP与DNA Mark〔宝生物工程(大连)有限公司〕；限制性内切酶(NEB)；PCR产物测序(上海博亚生物技术有限公司)；BIO-RAD PCR仪(USA)。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集 记录所有受检者的身高、体质量、血压、腰围、臀围，计算体质指数(BMI)和腰臀比；采用简化的MDRD方程计算肾小球滤过率(eGFR)，eGFR(ml·min-1·1.73 m-2)=186×Scr(mg/dl)-1.154×年龄(岁)-0.203(女性×0.7/42)，Scr为血肌酐；测定空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)，按稳态模型评估法计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR=FINS×FBG/22.5)及胰岛β细胞功能指数〔HOMA-IS=20×FINS/(FBG-3.5)〕；用酶联免疫吸附法测定单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)；用比色法测定UAER；用氧化酶法测定血糖；用酶法测定血脂(三酰甘油、总胆固醇)；用离子交换高压液相色谱法测定糖化血红蛋白(HbA1c)。

1.3.2 DNA制备 EDTA抗凝抽取外周血3 ml，严格按DNA提取试剂盒说明书制备基因组DNA，紫外分光光度计分别测A260 nm、A280 nm，确定纯度为1.6～1.8，DNA工作浓度为100 ng/μl。

1.3.3 PCR扩增 引物制备参考文献[2]。上游引物：5′-CAT TAG AAT AGC CTT CAC-3′，下游引物：5′-GAG TGA TTA CTG ACT AAA GG-3′。共20 μl的反应体系内含：10×Buffer(含Mg2+) 3.5 μl，dNTP(10 mmol/L) 1 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/L) 0.2 μl，引物(10 μmol/L)4 μl，DNA模板3 μl，双蒸水8.3 μl。反应条件：预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 45 s，退火50 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1 min，35次循环后72 ℃延伸10 min。

PCR产物用Eco571酶(5 U/μl)酶切，于37 ℃温育23 h，取特异性扩增产物10 μl和载样缓冲液(溴酚蓝)1 μl混匀，上样。电压150 V，电泳90 min，紫外分析仪下观察电泳结果并摄像。

1.3.4 电泳 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳方法进行分析，银染后判断基因型。

1.4 统计学方法 经Hardy-Weinberg平衡检验确认样本的群体代表性。计量资料以(x--±s)表示，多组间计量资料比较采用方差分析，若P<0.05再进行组间两两比较，采用q检验；计数资料比较采用χ2检验；发病危险因素采用两变量间的Pearson相关分析及Logistic回归分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PCR扩增及酶切结果 经限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析，PCR产物用Eco571酶酶切后发现了Ang-2第4外显子+1087位点的3种基因型：AA、AG和GG型。AA基因型有1个片段(250 bp)，AG基因型有3个片段(250 bp、150 bp、110 bp)，GG基因型有2个片段(150 bp、110 bp)。各基因型的电泳图见图1。

2.2 各组Ang-2基因型和等位基因频率 各组受检者Ang-2 A1087G的基因型频率和等位基因频率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中DN0组、DN1组、DN2组患者Ang-2 A1087G的AG+GG基因型频率和G等位基因频率与NC组比较，DN1组、DN2组与DN0组比较，差异均有统计学差异(P<0.05，见表1)。

2.3 各组受检者的临床生化指标比较 各组受检者的血脂、BMI、腰臀比比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而血压、HbA1c、eGFR、FBG、FINS、HOMA-IS、HOMA-IR、MCP-1、Ang-2水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中DN0组、DN1组、DN2组患者血压、HbA1c、eGFR、FBG、FINS、HOMA-IS、MCP-1、Ang-2水平与NC组比较，DN1组、DN2组HOMA-IR与NC组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；DN1组、DN2组的血压、eGFR、FBG、HOMA-IS、HOMA-IR、MCP-1水平与DN0组比较，DN2组Ang-2水平与DN0组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；且DN2组的eGFR、HOMA-IS、HOMA-IR与DN1组比较，差异亦有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.4 T2DM患者Ang-2 A1087G与MCP-1的相关性分析 DN0组Ang-2 A1087G携G基因型(AG+GG)与MCP-1呈正相关(r=0.578，P=0.012)；DN1组、DN2组患者Ang-2 A1087G携G基因型(AG+GG)与MCP-1呈正相关(r=0.628，P=0.011；r=0.843，P=0.003)。在固定性别、年龄、BMI等后，Pearson相关分析表明Ang-2 A1087G携G基因型(AG+GG)与HOMR-IR呈正相关(r=0.264，P<0.05)。

2.5 糖尿病并发肾病危险因素的分析 以DN发生为因变量，选择Ang-2基因型或等位基因及临床指标为自变量做Logistic回归分析，结果显示Ang-2 A1087G的AG+GG基因型、等位基因G、血清Ang-2水平、收缩压、HbA1c、FBG、MCP-1、HOMA-IS、eGFR进入回归方程(见表3)。

校正年龄、性别、糖尿病病程、HbA1c、血压等因素影响后，AG+GG基因型相对AA基因型发生DN0(即T2DM无DN)的危险性增加1.823倍〔95%CI(1.557，4.221)，P=0.011〕，G等位基因发生DN0的风险是A等位基因的1.442倍〔r=1.321，OR=1.442，95%CI(2.320，4.178)，P=0.030〕；发生DN1(即T2DM合并微量蛋白尿)的危险性增加1.778倍〔95%CI(2.356，5.220)，P=0.010〕，G等位基因发生DN1的风险是A等位基因的1.984倍〔r=1.021，OR=1.984，95%CI(2.621，4.574)，P=0.027〕；发生DN2(即T2DM合并大量蛋白尿)的危险性增加1.991倍〔95%CI(3.560，6.229)，P=0.001〕，G等位基因发生DN2的风险是A等位基因的1.881倍〔r=1.338，OR=1.881，95%CI(3.321，5.173)，P=0.001〕。

图1 Ang-2 A1087G PCR-RFLPR产物电泳图

Figure1 The electropherogram of PCR-RFLP of Ang-2 A1087G produces

表1 4组受检者Ang-2 A1087G基因型和等位基因频率比较〔n(%)〕

Table1 Comparison of Ang-2 A1087G genotype and allele frequencies among four groups

组别例数基因型频率AA AG+GG等位基因频率A GNC组254187(75 6) 67(24 4) 411(80 9) 97(19 1) DN0组431263(61 0)168(39 0)∗ 536(77 2)158(22 8)∗ DN1组322187(58 1)135(41 9)∗△449(69 7)195(30 3)∗△DN2组268148(55 2)120(44 8)∗△356(66 4)180(33 6)∗△χ2值14 3249 221P值0 0210 032

注：与NC组比较，*P<0.05；与DN0组比较，△P<0.05

表2 4组受检者临床及生化指标比较(x--±s)Table 2 Comparison of clinical and laboratory parameters in four groups

注：HbA1c=糖化血红蛋白，BMI=体质指数，eGFR=肾小球滤过率，FBG=空腹血糖，FINS=空腹胰岛素，HOMA-IR=胰岛素抵抗指数，HOMA-IS=胰岛β细胞功能指数，MCP-1=单核细胞趋化蛋白1，Ang-2=血管生成素2；与NC组比较，*P<0.05；与DN0组比较，△P<0.05；与DN1组比较，▲P<0.05

表3 T2DM患者并发肾病危险因素的Logistic回归分析结果

Table3 The multiple Logistic regression analysis of dangerous factors for patients with T2DM complicated with diabetic nephropathy

自变量βOR值95%CIP值Ang-2A1087G(AG+GG)基因型0 7321 801(2 532，4 318)0 010Ang-2A1087G等位基因G1 2971 432(2 311，4 893)0 031血清Ang-2水平1 5430 971(1 224，2 678)0 035收缩压0 6121 038(1 251，3 480)0 023HbA1c0 3571 312(2 157，4 439)0 015FBG0 4120 422(0 807，1 443)0 021MCP-10 7211 201(2 117，3 337)0 021HOMA-IS0 4361 256(2 733，4 109)0 012eGFR1 1221 012(2 277，3 889)0 040

3 讨论

近年来，糖尿病导致的终末期肾病(ESRD)发病率显著增加，且已逐步成为ESRD的主因。有研究显示，即使长期严格控制血糖，仍有20%～40%的糖尿病患者最终发展为糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)[3]。DN是糖尿病微血管并发症之一。DN和糖尿病视网膜病变都存在血管生成异常，DN早期肾小球肥大，毛细血管袢扩张，尿清蛋白排泄增多；晚期微血管大量退缩，肾组织缺血缺氧最终导致肾小球酸化和肾间质纤维化。已有研究表明，糖尿病微血管病变与多种血管生长因子的作用失衡有关[4]。Ang-2是近年发现的一类新的血管发生相关蛋白因子，在肾脏的基因表达主要与3种内皮损伤特征相关，即微血管瘤形成、内皮炎性浸润和泡沫化变形。DN的发生、发展与血管内皮功能障碍及许多因子的异常表达密切相关[5]，而UAER正是反映肾脏血管内皮细胞损伤的标志性指标。本研究发现DN0组、DN1组、DN2组Ang-2水平显著高于NC组，且DN2组Ang-2水平又显著高于DN1组，提示Ang-2水平有随着UAER的增加而升高的趋势；Ang-2可能通过损伤肾脏血管内皮细胞使肾小球毛细血管的渗透性增加导致蛋白尿，从而引发DN。这与顾卫红等[6]的研究发现Ang-2水平与尿蛋白/肌酐值呈正相关的结论相一致。血管发生异常在DN的发生、发展中起着极为重要的作用。在分析DN基因表达谱，寻找DN相关基因时，郑敬民等[7]观察到DN患者肾小球中Ang-2基因的表达水平明显升高，并且发现在基因芯片所包含的总共7个Ang家族成员中，仅Ang-2呈差异性表达，故推测其可能是一个有价值的DN发病相关基因。本研究结果显示，NC组、DN0组、DN1组及DN2组Ang-2 A1087G携G等位基因的个体(AG+GG)基因型频率逐渐升高，G等位基因频率在4组间亦有显著差异，这进一步证实Ang-2 G1087可能是DN发生发展的遗传易感基因。

近年来炎症在DN中的作用受到人们的重视，众多炎性细胞因子、黏附因子、趋化因子和生长调节因子等相互作用、相互交联，扩大了炎症的级联反应，促进了DN的进展。在机体的调节网络中，炎症的产生及发挥作用主要通过影响信号转导元件中起关键调节作用的基因，从而改变炎症相关下游效应蛋白的表达及活性，进而参与DN的炎症过程。Ang-2是内皮细胞炎症反应的自分泌调节因子，促进了内皮细胞对肿瘤坏死因子α(TNF-α)的敏感度和TNF-α诱导的内皮细胞黏附分子表达[8]。Ang-2可使内皮细胞的连接失去稳定性，促进炎症细胞的渗出；另一方面，TNF-α也可上调Ang-2的表达[6]。本研究发现NC组、DN0组、DN1组及DN2组血清MCP-1水平逐渐升高，且DN0组Ang-2 A1087G AG+GG基因型与MCP-1呈正相关，DN1组、DN2组Ang-2 A1087G携G等位基因与MCP-1呈正相关，更加证明Ang-2与炎症存在相关性。

DN不仅与遗传有关，还与其他多种原因有关。本研究结果显示，DN1组、DN2组FBG水平及HOMA-IR显著高于DN0组，HOMA-IS显著低于DN0组，说明β细胞功能明显下降，机体处于较高的血糖状态。高血糖通过蛋白激酶C(PKC)途径使NADPH氧化酶的活性增加，机体产生较多的活性氧自由基，进一步加重肾脏损害，从而导致DN较易发生[9]。高血糖还使细胞内丙酮醛增多，后者通过共价修饰Ang-2启动子结合蛋白mSin3A而直接调节Ang-2基因转录[10]。

在对2型糖尿病合并肾脏病变的多因素分析中，发现Ang-2 A1087G的AG+GG基因型、G等位基因、Ang-2水平、收缩压、HbA1c、FBG、MCP-1、HOMA-IS、eGFR与DN的发生有关。血清Ang-2水平是Ang-2基因表达的结果，Ang-2在血管内皮表达造成血管内皮损伤从而使得糖尿病微血管发生病变导致DN的发生；在病情由DN0向DN2的发展进程中，HbA1c、收缩压可互为因果关系；eGRF则是DN发生的病理生理基础——微血管病变的结果；FBG水平对微血管内皮氧化应激的触发起到很大的作用；MCP-1是否是介导了微血管内皮细胞的内质网应激的发生从而使糖尿病肾脏血管内皮的凋亡导致DN的发生尚待进一步研究；HOMA-IS的升高表明胰岛β细胞衰竭，导致胰岛素分泌减少，血糖升高，所起的作用与FBG所起的作用有异曲同工之效。

综上所述，Ang-2 A1087G携G等位基因的糖尿病患者易发展为DN，G等位基因是DN发生的独立危险因素，结合微量蛋白尿的检测和eGFR的检测，可以更早期、更有效地对该类患者进行预防和治疗。炎症参与了DN的发病，为DN的治疗提供理论依据。目前关于Ang/酪氨酸激酶受体(Tie)的研究方兴未艾，Ang在血管生成相关疾病中有广阔的应用前景，若能在DN早期正确干预，促进新生血管发育成熟、稳定及降低血管渗透，晚期预防微血管结构进行性破坏，则有望为阻止或延缓DN进展提供新的契机和方法。

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6 顾卫红，倪兆慧，顾乐怡，等.血管生成素与糖尿病大鼠肾组织中的表达与氯沙坦的作用[J].中国血液进化，2010，9(1)：32-35.

7 郑敬民，刘志红，张明超，等.血管生成素样蛋白2在糖尿病肾病小鼠肾组织中的表达定位[J].医学研究生报，2009，22(9)：912-915.

8 Fiedler U，Reiss Y，Scharpfeneck M，et al.Angiopoietin-2 sensitizes endothelial cells to TNF-alpha and has a crucial role in the induction of inflammation[J].Nat Med，2006，12(2)：235-239.

9 Lee HB，Yu MR，Song JS，et al.Reactive oxygen species amplify protein kinase C signaling in high glucose-induced fibronectin expression by human peritoneal mesothelial cells[J].Kidney Int，2004，65(4)：1170-1179.

10 Yao D，Taguchi T，Matsumura T，et al.High glucose increases angiopoietin-2 transcription in microvascular endothelial cells through methylglyoxal modification of mSin3A[J].J Biol Chem，2007，282(42)：31038-31045.