结核分枝杆菌(MTB)异质性耐药研究进展

柳清云 孙 刚 高 谦

(复旦大学上海医学院生物医学研究院 医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室 上海 200032)

20世纪40年代以来，链霉素、异烟肼、利福平等抗结核药物的广泛使用，使结核病的发病率和死亡率一度大幅下降［1］。但由于耐药结核，特别是耐多药结核(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药结核(extensivelydrug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的出现，给结核病的防控带来了严峻的挑战。据世界卫生组织(WHO)统计，2011年全球约有31万MDR-TB，其中约9%为XDR-TB，中国是全世界结核病第二高负担国家，MDR-TB病例数居世界首位［2］。

结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB)主要通过药物结合位点或药物活化基因等特定基因组区域的突变获得可稳定遗传的耐药基因型。例如，利福平耐药性是由于RNA聚合酶β亚基编码基因(rpoB)耐药决定区的点突变引起［3］，异烟肼耐药性主要由过氧化氢-过氧化物酶编码基因(katG)的突变导致［4］。通过检测这些基因的耐药相关突变，可以预测MTB的耐药情况。在检测临床分离培养的样本时，经常会发现敏感菌株和耐药菌株共存的现象，即异质性耐药［5］。异质性耐药因为影响药敏结果以及治疗方案的正确判断和评估而逐渐受到人们的重视。本文将对目前结核分枝杆菌异质性耐药的产生及其对临床的影响进行综述。

异质性耐药的产生 早在抗结核药应用之初，研究者就发现MTB存在异质性耐药的现象。由于MTB存在自发突变，即使是对药物敏感的MTB群体中也含有低频率(10－9～10－8)的耐药菌［6］，但此时耐药菌的频率过低无法检测，没有临床意义。抗结核治疗开始后，MTB群体中的敏感菌被逐渐杀死，耐药菌的频率逐渐上升，当达到临界值即被诊断为耐药结核病。由此可见，异质性耐药反映了MTB群体从部分耐药向全部耐药转变的中间过程，耐药性的定义也取决于耐药菌在样本中被检测到的频率。由于药敏测试方法的不同，其检测灵敏度也各不相同。Canetti等［7］于1969年总结了当时3种主流的药敏测试方法(绝对浓度法、耐药-比率法和比例法)的灵敏度、特异性和操作难易度等特点，建议以比例法作为MTB药敏测试的标准。WHO的结核病指南采纳了这一建议，规定当耐药菌的频率高于1%时(这一数值远高于MTB的自发突变频率)，即可诊断为有临床意义的耐药结核病［8］。这种以细菌在含药培养基中是否生长作为判断耐药标准的方法称为表型耐药检测，是目前耐药检测的金标准。

随着对MTB耐药机制的深入了解，通过检测耐药相关突变可以预测细菌的耐药性，即基因型耐药。在临床检测中，常会出现基因型耐药和表型耐药检测结果不一致或从同一样本中同时检出耐药基因型和敏感基因型的现象，提示异质性耐药的存在对基因型耐药检测结果有影响［5，9］。Rinder等［5］用 PCR和克隆方法对临床MTB异质性耐药进行了评估，通过检测异烟肼、链霉素、乙胺丁醇3种药物的耐药相关基因，发现分别有5/16、3/17、1/20的临床样本中同时存在携带耐药突变和没有耐药突变的MTB。Tolani等［10］用 GenoType MTBDRplus检测发现利福平耐药菌株中rpoB耐药异质性达34%(22/64)，异烟肼耐药菌中异质性耐药更高达65．7%(23/35)。此外，二线抗结核药物的耐药菌株中也存在异质性耐药。Chakravorty等［11］用分子信标检测技术发现韩国19．0%(8/42)的喹诺酮耐药为异质性耐药。Zhang等［12］用PCR扩增克隆并测序DNA旋转酶α亚基(gyrA)基因耐药决定区发现23%(54/235)的喹诺酮耐药菌株为异质性耐药。Streicher等［13］对氧氟沙星和阿米卡星耐药耐药基因作直接测序，发现异质性耐药在两种耐药菌中的比例分别为25%和 16．3%。

异质性耐药的现象促使人们研究耐药MTB的产生和发展过程。MTB耐药突变数据库(TBDReaMDB)的记录显示与同一种药物耐药相关的突变通常有多种甚至数十种［14］，而在临床检测中只发现其中的一至两种。由此引出的问题是，这些突变是如何在细菌群体中被筛选出来的?通过对同一患者连续采样，Mariam等［15］研究发现，在患者治疗过程中，MTB群体对链霉素先后产生了4种不同的耐药相关突变(编码30S核糖体蛋白的基因rpsL的K87R和K42R突变，16S核糖体RNA rrsA513C和A1400G突变)，但在治疗后期只有突变rpsL K42R在群体中被固定下来。本课题组Sun等［16］在近期的研究中用高通量测序技术更细致地研究了3例结核患者体内MTB异质性耐药的发展过程。研究发现在异烟肼耐药性产生的早期，同一细菌群体中存在4～5种与异烟肼耐药相关的突变(katG V1A，D94N和S315R突变，inhA的C-15T)，这些突变的频率之和接近100%，说明突变分布在不同的结核菌亚群中，几乎没有敏感菌存在。随着治疗进行，最终只有1种耐药突变的细菌亚群(katG D94N)的频率上升至主导地位(93．9%)，其他细菌亚群则逐渐消失，这提示携带不同突变的耐药菌亚群之间存在相互竞争并最后筛选出优势亚群。这种亚群间的相互竞争，又被称为克隆干扰，其结果使适应性最强的耐药结核菌脱颖而出［17］。

克隆干扰在亚群竞争中筛选出适应性较强的菌株，而适应性强的菌株可能通过两种方式获得，一种是不同耐药突变本身对细菌的适应性强弱存在差异［18］;另一种是细菌通过额外的基因组的突变补偿了由于耐药突变造成的适应性下降，这种现象称为补偿性突变。Comas等［19］研究证实，MTB rpoA及rpoC基因上的特定突变补偿了利福平耐药突变带来的适应性下降。我们课题组也发现，耐药突变出现之后，另有11个非同义突变在治疗过程中发生显著性变化，其中的6个突变频率在80%以上。这些突变所在的基因大多与细胞壁合成或跨膜转运相关，提示可能与耐药MTB的补偿性机制相关［16］。

异质性耐药对临床耐药检测的影响 目前，用于检测耐药结核病的分子诊断技术主要有Xpert MTB/RIF、GenoType MTBDRplus、Sloppy Molecular Beacon、Sanger测序等［11，20－21］。这些技术能够快速检测临床样本中的耐药突变，但对异质性耐药样本中耐药突变的检测灵敏度尚不能令人满意［22－23］。Chakravorty 等［11，24］开 发 的 Sloppy Molecular Beacon方法可以检测样本中比例在40%以上的利福平耐药突变和比例高于20%的喹诺酮耐药突变。Sanger测序可以检测出20%以上的耐药突变［5］。由此可见，分子诊断技术目前还难以达到表型耐药检测方法对异质性耐药的检测灵敏度。

对异质性耐药的检测灵敏度低将影响分子诊断技术对耐药结核病的预测率。在全球范围内，不同地区的实验室都存在基因型耐药和表型耐药检测结果不符的现象，且对同种药物耐药预测率差异较大［25－26］。为了验证了异质性耐药对分子诊断技术预测率的影响，Streicher等［13］对171株氧氟沙星耐药以及140株阿米卡星耐药的样本进行测序，发现分别有9和11个样本的基因型耐药与表型耐药检测结果不符，即在表型耐药的菌株中未检测到耐药突变。但通过对耐药菌株的耐药相关基因克隆并测序后发现，其中7/9喹诺酮耐药样本以及11/11阿米卡星耐药样本都能检测出gyrA或rrs突变。将这些异质性耐药菌株纳入考虑，该研究中耐药基因型对耐药表型的预测率将分别达到98．8%和100%。

当然，除异质性耐药影响耐药基因型对耐药表型的预测外，其他的因素还包括:(1)未知或其他耐药机制导致MTB耐药，Takiff等［27］发现外排泵系统可介导喹诺酮低浓度耐药，Zaunbrecher等［28］也发现氨基糖苷类乙酰基转移酶编码基因(eis)启动子区的特定突变可导致卡那霉素低浓度耐药;(2)体外培养可能导致耐药菌亚群比例下降，低于其检测灵敏度，Martin等［29］发现在体外培养中生长速率快的群体会掩盖生长速率慢的群体，由于MTB耐药性的产生通常伴随着生长速率的下降，体外培养可能导致其在群体中的比例变小或者消失。

研究异质性耐药的意义 研究异质性耐药，首先加深了对耐药结核病发生发展过程的认识。耐药MTB的成功建立，需要MTB在自身群体达到相当数量，发生多种不同突变形式(包括多种耐药突变)来应对抗生素压力，并以相互竞争的方式选出适应性最好的携带耐药突变的耐药细菌亚群［16］。这一过程中决定耐药突变种类的因素包括MTB在体内的复制时间，突变速率以及群体数量。由于细菌群体数量是决定自发突变数量的关键因素，因此在细菌群体数量较小的时候用药治疗，可以有效地降低耐药细菌的产生，这为早期诊断技术的应用提供了理论依据［30］。目前临床普遍采用的结核病诊断方法为显微镜检测，其检测的灵敏度需要在每毫升痰液中有10 000个细菌，而采用新的液体培养或GeneXpert分子检测灵敏度可以到达每毫升痰液10～100个细菌，灵敏度提高了100～1 000倍［22］。因此，普及灵敏的早期诊断技术，有利于在体内菌载量较小的时候及早治疗，这对于减少耐药菌株的产生，特别是减少适应性高的耐药菌的产生具有重要意义。

其次，检测异质性耐药对评估结核病治疗方案和指导临床用药具有重要意义。由于异质性耐药的原因，在低频率的耐药菌株存在时药敏结果为敏感，而针对敏感菌株的治疗方案最后可能由于耐药菌株的比例逐渐增加而治疗失败。而目前对MTB异质性耐药的认识还不深入，针对异质性耐药是否需要采取不同的治疗措施还有待探讨。在肿瘤治疗中，异质性的出现使抗肿瘤药物只能杀伤部分肿瘤细胞，而小部分存活下来的耐药肿瘤细胞则逐渐占据主体地位［31］。针对肿瘤的异质性耐药，目前主要采取增加药物剂量、靶向给药等方案进行特殊化治疗［32－33］。这些在肿瘤治疗领域的研究经验能否在结核病异质性耐药的治疗中得到借鉴，有待进一步的研究。

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