小口径人工血管及其内皮化策略的研究进展

陆树洋(综述) 孙晓宁 王春生(审校)

(上海市心血管病研究所-复旦大学附属中山医院心脏外科 上海 200032)

冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting，CABG)是目前外科治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要方法之一，其中5% ～30%患者需要两次、甚至两次以上的CABG或存在周围血管病变，缺乏合适的自身血管逐渐成为治疗此类疾病的最大问题［1］。因此，小口径人造血管(≤4 mm)［2］作为替代物的研究与开发成为国内外近十年来的热点。然而，目前所有小口径人工血管材料都存在一个致命的共同问题:血液相容性差。当其移植入体内后，容易导致血栓形成，远期还易出现内膜增生［1，3－4］。如果将直径≤4 mm 的小口径人工血管植到冠状动脉或外周小血管，血管堵塞率很高。要解决这些问题的关键是促使人工血管的表面尽快内皮化，形成具有功能的完整的内皮层可以有效抑制血管狭窄及堵塞的发生［1］。本文旨在对小口径人工血管及其内皮化的策略研究进展作一综述。

小口径人工血管的材料选择

聚四氟乙烯(Teflon，expanded polytetrafluor-oethylene，ePTFE) ePTFE是一种化学稳定性极佳的新型高分子材料，其由两层材料组成:内层材料呈纵向性 ，外层材料呈横向性 ，从而结合成为一种纵向、横向都极度牢固的血管壁结构。其管壁具有无数的微孔结构可以提高材料的顺应性，植入人体后，组织可迅速贴敷到血管外壁上，成纤维细胞和结缔组织在管壁微孔中广泛长入，从而较易在内壁形成完整而较薄的新内膜。ePTFE具有较高的负电性，膜薄、光滑，发生腔内凝血几率相对小，与人体组织相容性较好，同时其柔顺性强，易缝合，对人体无任何不良反应，可作为体内保持持久强度的血管代用品。ePTFE人工血管管壁没有纵向延展性，血管壁易生成假性动脉瘤，且植覆内皮细胞也有困难。此外，有机溶剂也可增加ePTFE人工血管移植物的多孔性和过滤性，容易形成移植物周围血清肿。

涤纶，即聚对苯二甲酸乙二醇酯(Dacron，polyethylene terephthalate，PET) 人工血管的材料起初是用奥纶、尼龙织成，后因在生物体内植入后结果均不理想而被淘汰。现在多采用PET纤维编织人工血管，已大量应用于临床。临床上使用的PET血管的编织方法主要有机织和针织两种方式。机织的人工血管是指多股PET丝线按经纬方向通过上下交叉编织，具有这种结构的人工血管孔隙率小、空间结构稳定。因此，机织人工血管具有较低的出血率和较低的植入后结构变形几率，其缺点是可改变的机械性能不足，顺应性差，修剪边缘易破损，与组织结合不牢固。针织人工血管是指通过PET丝线环扣成联锁结的编织方法进行制备。按周径编织的人工血管结构稳定性较差，所以绝大多数针织人工血管是通过沿经线方向进行编织的。Koper针织方法是用丝线在人工血管内表面按垂直正交的方法来编织以增加人工血管结构稳定性的。另外，利用编丝绒的方法在织物表面延长丝线圈的长度从而增加人工血管与组织的结合，人工血管外侧面的绒毛状丝线能保证人工血管跟周围组织的结合，但是内侧面的绒毛结构会增加纤维蛋白和血小板的固定。针织人工血管不足之处在于管壁皱折，有高度的多孔性，网孔较大，移植时渗血现象严重，使用前必须预凝。此外，与ePTFE相比，PET与周围组织反应较强，易激活血小板，抗血栓形成性较低，生物相容性也较差，炎性反应重。

聚氨酯(polyurethane，PU) PU是一种具有良好的理化性能、血液相容性和生物相容性的医用高分子材料。其具有良好的顺应性、韧性和弹性，耐磨、耐腐蚀，易加工，能采用通常的方法灭菌，还具有抗凝血功能，无致畸变作用，无过敏反应。可根据设计的要求，通过分子结构设计调整其物理化学性质。由于其具有优秀的机械性能，因此可通过加工技术控制孔隙度，调整达到与天然血管顺应性的匹配。然而，目前尚没有足够的证据说明PU人工血管优于ePTFE和PET人工血管，而且，有动物实验提示PU降解后产物2，4-甲基苯二胺具有致癌作用。

促进内皮化的途径 目前，促进组织工程血管内皮化的主要途径有两种:一是内皮细胞体外种植法，包括单期种植法、二期种植法以及自体静脉碎片快速种植法，二是内皮细胞体内原位表面化。

单期种植法:将用机械法或酶解法获取的新鲜内皮细胞在手术前较短的时间内种植于人工血管的管壁，然后直接用于手术。此种方法简便易行，然而直接获取的内皮细胞数量有限，并且种植的内皮细胞抗血流切应力差，难以确保种植后形成完整的内膜。二期种植法:将获取的内皮细胞先行离体培养，再高密度种植于人工血管表面。二期种植法较单期种植法可以获取足够的细胞数量，但是，体外内皮细胞种植法需要耗费大量的财力以及时间，需要具备一定的实验室硬件，同时，操作者需要具备娴熟的内皮细胞/内皮祖细胞的体外分离及扩增的能力。

内皮细胞体内表面内皮化主要有以下理论:(1)宿主血管内皮细胞从吻合口向人工血管的迁移，但是内皮化仅限于吻合口周围2 cm。(2)周围组织毛细血管内皮细胞通过人工血管壁的长入。周围组织的成纤维细胞、内皮细胞可以从多孔人工血管壁长入而形成人工血管内膜。孔径为60 μm左右的多孔人工血管材料较为理想。(3)循环内皮细胞在人工血管内表面的沉积。由于体外种植法的种种弊端，利用自体内皮细胞/内皮祖细胞促进移植物在体内表面内皮化成为近年来研究的热点。

促进内皮化细胞的选择 组织工程血管内皮化细胞来源包括成熟的内皮细胞、内皮祖细胞以及多能干细胞。诸多研究认为内皮祖细胞可能是内皮化细胞的良好选择。内皮祖细胞是一类未分化的成体干细胞，具有增殖和分化为成熟内皮细胞的潜能，它和胚胎源性成血管细胞具有相似的性状，主要来源于骨髓。健康个体外周血中内皮祖细胞的水平非常低，但粒细胞集落刺激因子或血管内皮生长因子可动员骨髓中内皮祖细胞释放到外周血中。成熟内皮细胞属于终末分化细胞，分裂增生修复损伤内皮的潜能很低，而内皮祖细胞修复能力很强，同时可以促进新生血管形成。大量体外及体内研究表明［5－6］，内皮祖细胞可以通过促进损伤血管再内皮化以及诱导缺血缺氧区的新生血管形成改善缺血器官的功能。一些研究者通过全身系统应用内皮祖细胞，促进其归巢到受损血管，可以有效促进其内皮化［7］。早期的一些研究同样表明［8－9］，在人工血管表面体外种植外周血来源或骨髓来源的内皮祖细胞可以在人工血管表面形成具有抗血栓性质的内皮界面。

促进小口径移植血管在体内皮化的策略

接枝抗循环EC/EPC膜受体的抗体 在人造血管表面形成光滑的内皮层是提高人工血管血液相容性、改善远期通畅率的最好途径。已有实验表明将体外种植CD34阳性细胞的人工血管移植至动物体内可以实现快速内皮化，减少血栓形成几率，提高血管的通畅率。然而，体外种植法的种种弊端使其难以普及。近年的研究发现人体外周血液循环中存在多潜能内皮祖细胞，可定向分化为内皮细胞，具有再生功能，在受损部位可加速血管内皮化［10］。设计针对内皮祖细胞/内皮细胞表面分子标签 CD34/CD133/VEGF-1、2的抗体，接枝到移植物的表面来捕捉循环中的内皮祖细胞及内皮细胞，较短时间内可实现内皮化。Rotmans等［11］研究可捕获CD34抗原阳性的内皮祖细胞的功能性人工血管，虽然植入猪体内后人工血管可以很快内皮化，但内膜仍然增生显著，未能有效控制再狭窄。失败原因在于研究应用的CD34内皮祖细胞捕获存在着局限性，所捕获的CD34抗原阳性内皮祖细胞存在以下特点:(1)抗原的特异性低，CD34抗原不是只表达在相对成熟的内皮祖细胞上，也表达在成熟脱落的内皮细胞上;(2)CD34+细胞可以分化为心肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等，因此，CD34+抗体捕获的细胞仍有向血管平滑肌细胞分化的潜力，且捕获的EPC分泌细胞生长因子(VEGF和HGF)，对EPC和血管平滑肌细胞都有扩增的作用，可导致内膜过度增生。研究发现［12－13］，CD133抗原阳性内皮祖细胞可以从外周血的单个核细胞分离，并在支持内皮分化的培养基中长期培养，内皮祖细胞对于剪切应力易于形成管状结构。CD133是一个高度保守的抗原，它只表达于未成熟的内皮祖细胞，在成熟的内皮细胞和单核细胞上不表达。外周血中内皮祖细胞广泛存在，且带有CD133抗原的内皮祖细胞具有更好的分化潜能、表达及分化特异的特点，因此，捕获CD133抗原阳性的内皮祖细胞支架可能会有更好的效果，目前国际上尚无此类研究报道。

接枝EC/EPC整合素特异性识别的功能性短肽整合素是细胞膜调控细胞黏附到材料表面最主要的蛋白，它有两种跨膜糖蛋白亚单位构成，α链和β链，它们以非共价键形式结合在一起。在膜外部分的α链和β链相互作用，形成功能化的异二聚体。整合素通过膜外部分结构与细胞外基质发生作用，通过细胞内结构与细胞骨架和信号分子发生作用，进而调节细胞黏附、运动、铺展、生长和分化。

RGD序列是组织工程领域最常用的功能性短肽，把其固定到人工材料的表面可以促进细胞的黏附，它存在于许多细胞外基质蛋白中，如纤粘连蛋白、波形蛋白以及胶原等。具有特定空间构象的短肽序列RGD作为配体与整合素特异性的结合而介导细胞与细胞、细胞与基质材料的黏附、迁移和增殖。Blindt等［14］研究发现把环状RGD(cRGD)包被到支架表面，体外及体内实验均证实其可以有效招募内皮祖细胞，抑制冠状动脉内膜增生。此外，REDV以及SVVYGLR功能性短肽序列也可以被整合素识别，介导细胞的黏附增殖以及迁移。

包被磁性分子 通过使用磁力促进内皮祖细胞滞留是促进内皮化的另外一种方法。Consigny等［15］首次提出通过外界磁场使得铁负荷的细胞在组织局部滞留的概念。然而，细胞黏附主要出现在磁场附近，需要较长的时间才能实现内皮化。Pislaru等［16］研究通过使PET人工血管进行磁性处理，促进超顺磁性标记的内皮细胞黏附，结果发现实验组与对照组促进内皮细胞黏附能力有显著差异。随后使用流动小室对黏附的细胞进行剪切力实验，流速在300 mL/min的情况下，有70%的细胞可以滞留，流速达到400 mL/min时仍有61%的细胞可以滞留。猪颈动脉血管移植模型进一步证实了磁力可以实现快速内皮化。Pislaru等［17］把这一技术理论运用到支架上，同样证实了磁性处理后的支架可以有效促进超顺磁性标记的内皮组细胞，是对照组的6～30倍。

与上述使用cRGD功能性短肽以及CD34抗体捕捉内皮祖细胞不同的是，通过磁力捕捉内皮祖细胞首先需要分离和磁性标记内皮祖细胞。然而，内皮祖细胞体外的分离培养需要时间较长，而且超顺磁性微球标记费用昂贵，该种方法很难运用于急诊患者。此外，铁负荷的内皮祖细胞远期作用以及他们能否有效促进内皮化尚不清楚。超顺磁性或铁标记的内皮祖细胞释放铁微球颗粒可以激发局部炎性反应，而且其不可生物降解。Pislaru等［17］使用镍材料包被支架，在一些个体上还出现了过敏反应。因此，进一步研究生物相容性的细胞标记颗粒以及磁性材料是该技术远期研究的关键步骤。

包被特异性结合EC/EPC的适体 适体(aptamers)来源于拉丁文，意思就是适合，它是单链核酸，通常由70～80个核苷酸构成，对于许多靶分子具有高度的亲和力和特异性，如肽、蛋白质、药物、有机或无机分子，甚至是整个细胞［18－22］。能与靶分子识别的基础是单链寡核苷酸所形成的复杂的空间三维结构。1990年首次报道［23－24］适体的产生通常需要在体外与配体相互作用进行选择和扩增的过程，称为通过指数浓缩向心配体的系统演变(SELEX)。这种方法通过使用一对引物序列从多达1 015种不同核苷酸序列库中化学合成出可以和靶分子高亲和力结合的核酸配体。分离出来的适体和靶分子具有高度的亲和力，他们的离解常数从纳米级到皮克级，不逊于甚至优于单克隆抗体。与抗体相比，适体在诊断分析方面有下面一些优势:首先，适体是通过体外过程制备，不需要依赖动物或者细胞等在体环境。正因为这些，可以为一些具有毒性的以及无免疫原性的靶分子制备适体。适体的生物利用度以及药代动力学可以通过化学修饰来保护适体在生物环境中不失活，比如通过化学修饰使适体可以抵抗核酸酶的消化。再者，适体易于长期存放，同时变性有可逆性。一旦失去活性也可以在数分钟内恢复本来的构象。

Hoffmann等［25］使用SELEX技术合成了对循环中内皮祖细胞具有高度亲和力的适体。因为缺乏猪内皮祖细胞表面分子标签(CD133，CD34和VEGFR-2的单克隆抗体)，他们使用鼠抗猪CD31抗体包被磁珠来分离CD31阳性细胞。CD31分子广泛表达在白细胞、血小板、内皮细胞以及循环中内皮祖细胞的表面。通过运用SELEX技术，他们合成单链DNA适体针对猪CD31阳性细胞亚群，通过流式细胞仪挑选出72%的CD31阳性细胞。这些适体需要共价结合到高分子聚合材料上，进一步评估它们在流体状态下的性能。把适体包被到人工材料表面可以特异性捕捉内皮祖细胞，使得材料抗炎、抗栓能力增强，使其在较短的时间内实现内皮化。把对内皮祖细胞有高亲和力的适体以及无意义的适体分别包被到材料表面，通过猪在体实验验证，发现实验组适体可以猪血液循环中捕捉CD31以及CD144阳性细胞，而对照组材料表面没有此类细胞贴覆。经过培养10天，这些细胞表达内皮细胞特性。该研究表明适体在流体环境下可以捕捉循环中的内皮祖细胞。目前，还有在体实验研究适体在捕捉内皮祖细胞促进心梗后心肌修复过程的优势。这种新型的分子技术对促进植入体内材料的内皮化有着非常有益的作用。通过有效的捕捉内皮祖细胞可以缩短内皮化的时间，提高临床医用材料的应用，同时也丰富了组织工程技术。

人工血管的基因修饰 人工血管的基因修饰是利用基因工程技术，将目的基因转入到人工血管内皮化的内皮细胞中，增强其分泌细胞因子的能力，促进其黏附生长以及抗血栓功能。目前，已有多种基因，如beta半乳糖基因、组织型纤溶蛋白原基因、血管内皮细胞生长因子基因和血栓调节蛋白基因等用于内皮细胞基因修饰研究，体内及体外实验研究也初步显示了这一技术的良好前景。然而，在取得一定进展的同时，也存在一些需要解决的问题:基因修饰后使得内皮细胞在获得新功能的同时，其黏附性及增殖功能也受到影响。

结语 小口径人工血管移植后远期通畅率的问题仍然是目前亟待解决的首要问题。尽管目前促进内皮化的方法有很多，但每种方法都有其缺陷，没有一种能从根本上解决远期通畅率问题。理想的人工血管植入体内需要具有良好的力学性质，同时还能发挥一定的正常血管的生理功能。单纯从内皮化的角度可能还远远不够，还要从人工血管材料以及基因修饰等多种手段，综合提高小口径血管临床应用所面临的问题。

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