钙离子依赖型凝集素样受体2(CLEC-2)研究进展

吴利俊(综述) 刘 杰(审校)

(复旦大学附属华山医院消化科 上海 200040)

钙离子依赖型凝集素受体超家族成员之一——钙离子依赖型凝集素样受体2(calcium-dependent lectin-like receptor 2，CLEC-2)是近年发现的血小板表面受体，相对分子质量(Mr)约32 000，属于Ⅱ型跨膜受体，主要介导血小板聚集和活化效应［1］。蛇毒蛋白Rhodocytin和唾液酸样糖蛋白Podoplanin是目前被分别鉴定出的CLEC-2的外源性和内源性配体。CLEC-2与配体相互作用对于血栓形成和维持粥样硬化斑块的稳定性至关重要［2］。同时，Podoplanin 与CLEC-2结合后可通过活化血小板后促进肿瘤转移和进展［3］。此外，CLEC-2的抗血清还能阻断HIV-1与血小板的结合，而血小板又参与了呈递HIV-1至靶细胞，继而感染宿主细胞的过程，提示CLEC-2可能参与血小板捕获HIV-1的过程［4］。基于CLEC-2与多种疾病的相关性，阻断其与配体相互作用可能是治疗上述疾病的新方法。本文就CLEC-2及其与肿瘤等疾病的关系作简要综述。

CLEC-2的结构与功能

CLEC-2的来源和表达 CLEC-2属于钙离子依赖型凝集素受体超家族一员，该家族至少含有70种人类跨膜蛋白，含有钙离子依赖型结构域(C-type lectin like domain，CTLD)，共分为 14 个组［1］。而按照是否含有钙离子和糖类识别位点共有序列，又可将该家族分为典型和非典型两大类。CLEC-2属于第5组非典型凝集素样受体。

CLEC-2的编码基因位于12号染色体，其相对分子质量为32 000。CLEC-2最早从人骨髓细胞内被克隆出来，其cDNA最早被报道是选择性表达在肝细胞和一些骨髓来源血细胞上，如单核细胞、树突状细胞和粒细胞上［5］。最近发现CLEC-2在血小板表面也有表达［6］。

CLEC-2的结构特征 CLEC-2属于Ⅱ型跨膜受体，其跨膜区由41个氨基酸构成，胞质尾区由31个氨基酸构成，包含3个重要结构:一个YXXL序列、21和27位两个保守的丝氨酸序列、9位部分保守的苏氨酸序列，其中YXXL序列对于CLEC-2信号转导过程非常重要。CLEC-2调节Syk就是通过在血小板表面形成二聚体，每个Syk具有的两个串联SH2结构域分别与CLEC-2胞质内尾巴上的单个磷酸化YXXL序列结合，即CLEC-2与Syk以2∶1形式结合。CLEC-2以这种二聚体形式来介导血小板活化与聚集等效应［7］。

CLEC-2的配体和信号转导途径

外源性配体Rhodocytin 蛇毒蛋白Rhodocytin，也称Aggretin，是同时被两个实验室从蝰蛇的毒液中纯化出来的一种蛋白［8－9］。Rhodocytin 以 60 000(αβ)2四聚体形式存在，αβ亚基共享39%同源序列，每个亚基都具有典型的C型凝集素样折叠特征，具有两个反平行β折叠，两个α螺旋侧翼。Aggretin具有很强的活化血小板的功能，但在引发血小板聚集前，有一段延迟滞后时间，但随着蛋白浓度的增加，延迟时间缩短［8－9］。最初认为该蛋白也是通过整合素α2β1或者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ介导信号转导，但Rhodocytin缺乏阳离子共作用残基，并不能与糖类相互作用，后来被证实该过程是通过CLEC-2来实现的［10］。

CLEC-2表面结合位点是一个长环状结构域，而Rhodocytin四聚体则包含两个由αβ异二聚体构成的凹陷结合表面，因此，能够同时适应两个CLEC-2分子聚合定位产生二聚体。同样，Rhodocytin四聚体结构还能保护CLEC-2分子处于静电和疏水效应均优化的位置，配体与受体结合以后能够促发血小板表面CLEC-2的高度有序聚合，引起强烈的血小板聚集效应［11］。

内源性配体Podoplanin Podoplanin(Aggrus)是I型跨膜唾液酸样糖蛋白，包含一个富含Ser/Thr残基的细胞外结构域，这些残基是潜在的原位多聚糖位点，以及一个单一的跨膜部分和一个短的胞质内尾巴，该尾巴含有的YXXL模块可能是蛋白激酶C(PKC)和cAMP磷酸化位点［3，12－13］。Podoplanin 在很多肿瘤细胞上都存在高表达现象，包括鳞状细胞癌、睾丸精原细胞瘤和脑肿瘤［14］。Podoplanin在肾小球上皮细胞(足细胞)以及在I型肺泡细胞和淋巴内皮细胞上丰富表达［15－16］。Podoplanin缺陷鼠在出生时即死亡，因为呼吸衰竭以及淋巴缺陷，提示Podoplanin在淋巴管形成过程中非常重要［17］。

CLEC-2信号转导途径 CLEC-2与配体结合以后，调控活化信号依赖蛋白酪氨酸磷酸化，包括酪氨酸激酶Src、Syk、适配体蛋白SLP-76以及PLCγ2。即CLEC-2信号转导途径是通过Src、Syk依赖酪氨酸激酶，使得一系列适配体和效应蛋白发生磷酸化，累积激活PLCγ2和血小板活化。该过程与GPⅥ介导的血小板聚集不同，CLEC-2是以二聚体形式发挥作用，激活Syk仅是通过胞质尾巴内的单个YXXL序列，仅是部分依赖适配体蛋白SLP-76，与另外两种凝集素受体类似，即 Dectin-1、CLEC9A［11，18］。Podplanin 与 CLEC-2结合后能够引起多个CLEC-2分子的胞质信号段靠近，细胞内信号转导途径与CLEC-2和Rhodocytin作用过程相似。

CLEC-2与疾病的关系

CLEC-2与血栓性疾病 血管壁完整性的损伤会导致内皮下细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的暴露，激活血小板和促进聚集，这是止血的初始过程。CLEC-2缺陷能够导致出血时间延长和保护免受动脉闭塞症血管内血栓形成的威胁。在血管损伤部位，多个血小板受体/配体相互作用信号途径协同作用，确保血循环内有效的血小板黏附和血栓形成，而CLEC-2依赖信号途径对于维持血循环内血栓及斑块的稳定性至关重要［19］。粥样硬化斑块破裂可导致动脉闭塞和栓子形成，引起心梗和卒中，因此抑制血小板功能能够预防和治疗缺血性心脑血管疾病。

CLEC-2与肿瘤转移和进展 Sugimoto等［20］早期使用单克隆抗体8F11抑制鼠高转移性结肠腺癌26细胞株肺转移的研究发现，高转移克隆株，即变异株 NL-17，能够表达更多的Podoplanin(Aggrus)并诱导大量血小板聚集，而抗Aggrus抗体8F11则能够抑制血小板聚集，且减少结肠腺癌在肺部的定植。随后，在结肠癌患者中也发现Aggrus在癌组织中的表 达 明 显 高 于 癌 旁 组 织［12］。Podoplanin/CLEC-2依赖的血小板聚集具有促进肿瘤转移的作用，可能是通过形成“血小板帽”结构，从而保护肿瘤细胞免受机械力影响。但是它们的相互作用并非局限于帮助肿瘤细胞转移，活化的血小板还能够释放很多储存在血小板内的细胞因子，包括血管内皮生长因子、血小板趋化生长因子和鞘氨醇1-磷酸。这些细胞因子可能与血小板表面黏附分子共同参与肿瘤新生血管形成，从而促进肿瘤生长。因此，阻断Podoplanin和CLEC-2的相互作用可能是阻止肿瘤细胞生长和转移的一个靶点。

CLEC-2与HIV-1感染 血小板能够表达细胞表面黏附分子，与HIV-1相互作用后使病毒集中在细胞表面，增加包膜蛋白与CD4和辅助受体的结合机会，并且保持病毒的感染力持续数天，从而增强病毒感染力，尤其是当病毒受体表达处于低水平的时候［21］。HIV-1与血小板结合活性一定程度上能够被CLEC-2的抗血清所抑制，提示CLEC-2参与血小板捕获HIV的过程［22］。HIV-1与CLEC-2的相互作用能够诱导血小板活化，导致反式感染和病毒退化，影响病毒感染和疾病进展。此外，CLEC-2在肝窦内皮细胞和巨核细胞上也有表达，这些细胞对HIV都是易感的。因此，CLEC-2可能参与调节HIV-1在感染者体内的传播。血小板能够同时表达DC-SIGN和CLEC-2，但是这两种蛋白是通过不同机制来捕获HIV-1，前者直接结合到HIV-1包膜蛋白，而CLEC-2是通过识别一种结合在病毒颗粒上的宿主细胞因子。HIV-1与CLEC-2作用过程可能是通过目前未被鉴定的CLEC-2的内源性配体来介导［23］，而并非已知的Podoplanin，因为Podoplanin在HIV-1最主要的靶细胞——变异 T细胞上并无表达。虽然Podoplanin可能并不直接介导HIV-1捕获过程，但是其在很多肿瘤，包括Kaposi肉瘤中有高表达现象［24］，提示 Podoplanin可能参与 AIDS相关 Kaposi肉瘤的进展而不是调节HIV-1在体内的传播过程。

CLEC-2未来研究方向 关于CLEC-2及配体在生理状态下的相互作用仍不清楚。近来有研究表明CLEC-2在滋养细胞上也有表达，该分子可能参与滋养细胞生物学行为，维持正常妊娠的稳态，且有可能是通过ERK、JNK信号途径来调控［25］。因此，进一步发现CLEC-2更多的生理功能也是重要的研究方向，如更多的内源性或外源性配体及其相互作用等。此外，前述多种疾病均与CLEC-2存在相关性，但是目前机制并不明确，如血小板通过何种内源性配体来实现捕获HIV-1、人体中CLEC-2表达与肿瘤转移的关系如何等。因此，深入探讨这些问题，能够为预防和治疗相关疾病提供新思路。

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