肿瘤干细胞(CSCs)放疗抵抗机制的研究进展

燕 丽(综述) 乔田奎 范 卫(审校)

(复旦大学附属金山医院肿瘤科 上海 200540)

随着肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)这一概念的提出，越来越多的研究探讨CSCs在肿瘤治疗中作用，已有研究发现CSCs是肿瘤治疗后复发的根源，根治肿瘤首先应该根除CSCs[1］。手术是治疗肿瘤的最佳选择，但很大一部分患者前来就诊时已经失去了手术的最佳时机。放疗是肿瘤治疗中的主要手段之一，约70%的患者需要放疗的参与，但放疗后肿瘤往往还会复发，这多与肿瘤中存在的小部分CSCs对放疗存在抵抗有关。本文就CSCs产生放疗抵抗的机制作一综述。

CSCs DNA损伤修复能力与放疗抵抗 DNA 作为射线对细胞作用的关键靶点，其损伤后迅速修复是放疗耐受的关键原因[2］。DNA损伤后，首先损伤应答激酶细胞周期检测点激酶ATM和ATR接收DNA损伤的信号，发生磷酸化，随后激活一系列细胞周期检测点效应分子如激活效应酶Chk2和Chk1等，最终引起细胞周期阻滞或直接进行DNA损伤后的修复[3］。

细胞周期阻滞与DNA修复 许多研究发现[4-6］，不同损伤原引起DNA损伤后，机体启动p53、ATMChk2、ATR-Chk1DNA损伤应答通路，引起G1、S和 G2期的阻滞，使受损细胞有足够的时间来自我修复从而产生放疗抵抗，同样射线引起CSCs DNA损伤后，其损伤的DNA也会通过细胞周期阻滞来进行修复。田允鸿等[7］用无血清悬浮法富集 MCF-7细胞系中CSCs，探讨其细胞周期与射线照射后产生耐受之间的关系，流式细胞仪分析细胞照射前后其细胞周期变化，Western blot法测定照射前后G2期相关蛋白pCDC25C含量，结果乳腺癌干细胞在经射线照射前后G2期细胞含量分别为22.03% ±2.12%和45.83% ±2.25%(P ＜0.01)，pCDC25C 在照射后表达明显增高，而贴壁培养的乳腺癌细胞照射前后细胞周期及周期相关蛋白均无明显差异，可见乳腺癌干细胞经射线照射后出现的G2期阻滞可能与其放疗耐受特性相关。那么G2期相关蛋白pCDC25C是如何发挥作用的呢?马晓洁[3］曾提出细胞通过G2/M期阻滞进行自我修复涉及的路径为损伤信号→ATM/ATR激活→Chk2/Chk1激活→CDC25CSer26位点磷酸化;损伤信号→ATM/ATR激活→P53激活→14-3-3σ激活，14-3-3σ与磷酸化的CDC25C结合使CDC25C磷酸酶失去对细胞周期相关蛋白CDC2-Tyr15位点去磷酸化的功能→CDC2活性抑制→CDC2/cyclinbB抑制→G2，可见pCDC25C作用至关重要。Furnari等[8］提出DNA损伤后产生磷酸化的CDC25C的细胞会同时产生胞质蛋白14-3-3δ结合点，最终留在胞质不能进入细胞核，导致 G2/M 期阻滞。Lopez-Girona等[9］认为DNA损伤引起细胞周期检测点激活，而后在Chk1及Rad24的协助下将磷酸化的CDC25C从细胞核中排除，导致G2/M期阻滞。Hambardzumyan等[10］提出胶质瘤干细胞产生放疗抵抗与细胞周期调控蛋白Chk1、Chk2有关，用 Chk1、Chk2蛋白抑制剂 DBH将其阻断后，细胞周期调控阻断，经射线照射，胶质瘤细胞系D456MG中CD133+细胞较CD133-细胞对射线的敏感性明显增加。王彬[11］通过CD133免疫磁珠分选恶性胶质瘤细胞株的U251中的CD133+细胞，射线照射后，细胞周期分析发现CD133+细胞大多数处于G0～G1期，占88.2l%，G0～G1期阻止了细胞的增殖，从而对放疗产生耐受。细胞周期阻滞会导致放疗耐受，但其背后的分子机制尚需进一步研究，深入了解相关肿瘤放疗后其特定的周期阻滞及引起该周期阻滞的信号转导机制，可以进行靶向阻断，解除细胞周期的阻滞并最终解除放疗耐受。

DNA损伤修复基因表达与放疗耐受 Gaedcke等[12］曾指出细胞损伤后其死亡还是存活与相关基因的表达密切相关。那么CSCs放疗损伤后其基因表达情况又是如何呢?陈宝敏等[13］在人胶质瘤干细胞系中筛选出了与DNA损伤修复相关的MGMT基因，其在常规培养条件下的胶质瘤中不表达，但在干细胞培养条件下呈现轻度增高表达;Hegi等[14］提出该基因与DNA损伤修复相关。可以推测该基因在细胞损伤修复中起重要作用。李治等[15］将人乳腺癌干细胞经过8Gy射线的照射后，发现其ATM和Ku70/Ku80的基因表达水平上调且表达量明显高于非乳腺癌干细胞。ATM和Ku70/Ku80的基因产物能够在细胞DNA出现损伤时保护损伤的DNA不被降解，并加速损伤DNA的修复，从而通过细胞凋亡产生放疗耐受。Chang等[16］也指出敲除SirT1基因可明显增加胶质瘤干细胞的照射敏感性，其原因可能与该基因参加细胞周期调控及DNA损伤修复相关。

除了CSCs，致瘤性间质干细胞与射线抵抗相关的基因表达也有报道。Horsman等[17］研究产生放疗耐受的人致瘤性间质干细hMSC-TERT20-CE8在不同剂量的放射线下其基因表达情况，结果发现CE8克隆系的细胞内发现了15种已经证实的基因过度表达，其中表达增长5倍以上的包括CTSC、GMFG、EFEMP1、NNMT、CXCL1、CASP1 基因。通过信号转导的路径分析发现这些基因与肿瘤细胞致瘤性、细胞增生、细胞凋亡、DNA复制、重组关联重大。其中基因NNMT的表达促进尼克酰胺的降解和排泄，而尼克酰胺可以阻挡断裂的单链DNA的修复，从而使损伤DNA的修复速率增加。这项研究也发现BAX、CDKN1A和MDM2基因明显增加，而这些基因表达的最终结果是促进细胞的凋亡并将细胞阻滞在G1/S期，从而抑制细胞的有丝分裂，即在肿瘤间质干细胞细胞受到损伤后，既有促进细胞凋亡的基因表达，又有促进细胞损伤修复的基因表达，因此可根据肿瘤细胞不同的基因表达水平预测其对射线的敏感性。从基因水平上探究CSCs与放射线之间的关系，有助于从基因水平上阐明CSCs抵抗放射治疗的机制，提供增强肿瘤患者放射治疗敏感性的基因靶点。

DNA损伤修复相关蛋白激活或聚集与放疗耐受 Marchetti等[18］提出DNA损伤后会有173种蛋白质表达水平的增加和磷酸位点的改变，其中任瑞平等[19］总结过DNA损伤修复蛋白包括 H2AX(磷酸化组蛋白)、ATM(细胞周期蛋白)、CDKNlA(细胞周期相关酶抑制蛋白)、TP53(肿瘤抑制相关蛋白)等在DNA损伤修复中的作用。

Bao等[20］在脑胶质瘤中发现CD133+的胶质瘤干细胞，其经过短期射线照射后体外培养的CD133+细胞比未经照射的富集了4倍，体内生长的脑胶质瘤经过同样处理后CD133+细胞比未处理的富集了3～5倍。通过单细胞凝胶电泳测定技术发现:无论是异体移植的胶质瘤还是人脑胶质瘤，在接受放疗后CD133+细胞中的DNA周期检测点蛋白(ATM Rad17，Chk1 and Chk2)比 CD133-细胞中的检测点蛋白活性高出许多，且其存活率是CD133-细胞的4～9倍，可见DNA损伤检测点蛋白的高活化状态导致癌症干细胞更有效地对损伤DNA进行修复，结果在接受放射性治疗后幸存。

DNA的损伤包括单链和双链DNA损伤，其中DNA发生双链断裂后最早反应之一是位于断裂点附近的组蛋白H2AX的c末端丝氨酸残基发生磷酸化，形成 γ-H2AX[21］。Wu 等[22］提出磷酸化的 r-H2AX能快速转导DNA损伤信号，招募DNA损伤检测点蛋白MDC1和DNA修复蛋白复合物到DNA损伤点形成DNA修复焦点。并且 Rothkamm等[23］指出无论何种因素诱导的双链DNA的损伤都伴随有H2AX的磷酸化，而且都要经历聚焦后消失的过程，可见磷酸化γ-H2AX组蛋白对于DNA损伤修复起着至关重要的作用。Booher等[24］先前的研究也发现，在放射治疗的干预下CSCs的存活比例明显高于非CSCs;并发现CSCs对射线的抵抗性增高也是通过激活细胞周期检测点蛋白实现的，在小鼠的乳腺癌干细胞中γ-磷酸化H2AX组蛋白聚集后消融的速率明显高于非乳腺癌干细胞，可见乳腺癌干细胞DNA损伤后修复速率要快得多。Al-Assar等[25］根据CSCs特异性标记物的不同，用荧光激活细胞/磁珠法分选不同类型肿瘤细胞系中的CSC，随后检测经射线照射后其γ-磷酸化H2AX组蛋白消失速度，结果发现乳腺癌干细胞、胰腺癌干细胞Panc-1和PSN-1其γ-H2AX的消失速度要快的多，提示其有耐受辐射作用。但事实上，只有乳腺癌干细胞产生了抵抗射线照射的结果。这说明并非所有CSCs都表现出辐射抵抗及γ-H2AX的快速消失，或者通过CSC表面标记物分选CSCs的方法在研究其特性的问题上尚存在质疑，用这种方法分选的CSCs并不能很好地表示CSCs的特性，这对以后我们分选及研究CSCs有较大的启示。我们可以利用DNA损伤修复蛋白抑制剂特异性地阻断CSCs的损伤后修复，进一步提高肿瘤患者的放疗敏感性。

CSCs与其微环境的相互关系

CSCs与周围血管 董雪涛等[26］提出脑CSCs定居于血管周围小生境中，受小生境中细胞因子和信号通路分子的调节以维持其干细胞特性、保持自我更新和分化的平衡以及是否从小生境中迁出，同时脑CSCs也分泌一些细胞因子以维持小生境结构，破坏保护脑CSCs的小生境，可能使脑CSCs失去对不同剂量射线和化学药物的抵抗性。李明武等[27］在脑胶质瘤组织中，发现血管内皮细胞可表达CSCs的标记物CD133+和Nestin+。由此认为，肿瘤内微血管可能来源于CSCs的分化，推测CSCs可能以促进血管再生及定居于血管周围的方式使肿瘤处于足氧状态从而产生辐射抵抗。

乏氧效应 肿瘤组织内乏氧细胞的存在是影响射线照射效应的重要因素。细胞含氧状态对射线辐射杀伤作用有很大影响:射线对乏氧细胞杀伤力减弱，对氧合细胞杀伤力明显增强。肿瘤组织常有供血不足及乏氧细胞比率高的问题，部分癌细胞可逃避放射损伤，这是放疗后肿瘤再生长及复发的常见原因之一。乏氧微环境下，乏氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)高表达，最新研究结果表明[28］，HIFs可以诱导与CSCs自我更新和多能性相关的基因表达，包括Oct4和Notchl等，它们在乏氧微环境中经过一系列信号转导，最终使CSCs保持在未分化状态或者使CSCs的分化得到抑制。Platet等[29］将3种脑胶质瘤和2种少突胶质细胞瘤株分别在20%和3%氧环境下培养，结果发现在3%氧环境培养下各种细胞株的CD133+细胞比例较20%氧环境培养时均明显上升，可见乏氧环境下增殖明显增加。Xing等[30］提出乏氧环境下乳腺癌细胞中Notch受体和Notch配体Jagged2的表达明显上调，而且Jagged2配体在骨髓基质细胞中也有发现，其通过激活Notch信号途径的转导促进CSCs的自我更新。Oliveira等[31］用免疫组化分选出CD44+口腔癌干细胞，并发现在乏氧环境下其乏氧诱导因子σ和CD44+同时表达时对口腔癌的治疗效果产生明显的影响。

其他 谷胱甘肽是修复受损DNA所必需的巯基化合物，与肿瘤放射敏感性之间呈负相关。Mitchell等[32］曾经指出高能辐射对DNA的损伤作用包括直接损伤和间接损伤，射线对DNA分子链的直接作用为单链断裂和双链断裂;间接作用是射线对水分子的电离，产生自由基，自由基再与生物大分子一起作用于DNA链，此时细胞内的谷胱甘肽作为一种自由基清除剂在亚致死肿瘤细胞的修复上起重要作用，谷胱甘肽在放疗后表达水平增高与放疗敏感性有很大关联。Croker等[33］在 ALDHhiCD44+乳腺癌干细胞的研究中发现其明显的辐射抵抗与其细胞内高表达谷胱甘肽S-转移酶、P糖蛋白等有关。可见明确谷胱甘肽产生的来源并将其靶向阻断有利于肿瘤放射治疗的进展。

结语 随着CSCs在各类肿瘤中不断被分选出来，越来越多的研究说明CSCs在肿瘤放射治疗中起着重要的作用，CSCs的消灭与否关联到肿瘤能否得到根治，而目前要想克服CSCs对各种射线的抵抗还面临着不少的挑战。首先，在现有的基础上进一步研究并证实CSCs辐射耐受的机制，包括射线照射后CSCs完整的DNA损伤后修复机制、基因调控、损伤修复的信号转导途径、CSCs与小生态环境包括乏氧环境之间的相互作用机制等。其次，在明确CSCs辐射抵抗的机制后，寻求逆转该抵抗的分子靶向治疗，如以CSCs DNA损伤检测点为靶点阻断射线照射后DNA的修复;以细胞周期转换关键酶为靶点，阻断关键酶的作用，解除CSCs细胞周期的阻滞;了解射线照射后基因的转录表达后，靶向阻断抵抗射线的基因表达而提高射线增敏基因的表达;在明确乏氧环境对CSCs放射敏感性影响的前提下，探究是否可通过创造足氧环境提高肿瘤放射敏感性等，从而彻底消除CSCs对放射治疗的抵抗，达到根治肿瘤的目的。

由此可见，解决CSCs射线抵抗将为肿瘤的根治提供良好的应用前景。

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