微小RNA与临床疾病

冯忠军 孙寅 冯彦蕊 闻海丰 于文静

2.济宁医学院附属医院检验科，山东，济宁 272129

微小RNA（microRNA，miRNA）是继小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）之后又一类最新发现的在真核生物体内广泛存在的内源性单链小分子RNA。miRNA作为天然存在的重要的基因表达调控分子，自发现以来一直是国内外医学研究的焦点。有报道证实存在于miRNA及其靶位点的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）和人类疾病的发生有密切关系[1]。特定miRNA表达谱可辅助临床对疾病进行诊断、分型及预后，而以miRNA为靶点设计并开发新型分子药物，可以为许多疾病尤其是肿瘤治疗开辟新的途径。

1 miRNA的研究方法

选择正确的研究方法可为揭开miRNA参与人体生命过程的神秘面纱创造有利的条件。对于miRNA具体功能的研究，首先通过生物信息学预测候选miRNA基因，然后选择合适的提取方法和检测技术对其进行鉴定和验证，基本上可以满足大多数实验的要求。

1.1 miRNA预测

当前知名miRNA数据库有miRBase（http://www.mirbase.org） 及 miRNAMap（http://mimamaP.mbc.nctu.Edu.tw）等。它们提供了miRNA的具体位置，碱基序列和已知靶基因等生物学信息，基于这些数据，然后使用计算机软件通过结构序列分析法、比较基因组法及机器学习类算法就可以在数据库中初步筛选新的miRNA基因。结构序列分析法可辨别单物种中不同miRNA分子。比较基因组法主要用于对多物种序列高度相似的miRNA进行预测。机器学习类算法将miRNA初级序列和其二级序列进行结构组合从而进行筛选和预测新序列，在这三种方法中应用效果最好[1]。

1.2 miRNA提取

组织/细胞 miRNA提取方法主要有两种：液相提取法和硅胶膜特异性吸附离心柱法。前者由于多次离心并使用乙醇洗涤沉淀总RNA，对小分子RNA损失较大，因此不适用于cDNA 文库构建和Northern blot等对 RNA 完整性要求比较高的实验。而后者则使用特殊硅基质膜特异性吸附包括小分子RNA在内的总RNA，对于长度为15～30 nt左右的siRNA和miRNA提取效果非常好，不过成本较高。循环miRNA的提取目前有很多试剂和商品化试剂盒可供选择，如Invitroge公司的Trizol LS Reagent、Ambion的mirVana PARIS试剂盒以及北京天根miRcute miRNA提取分离试剂盒，独特的裂解液配方对血液、血清/血浆、脑脊液等体液标本可实现快速抽提并分离RNA，一般单个样品的操作30 min内即可完成。

1.3 miRNA检测

当前miRNA检测技术大致可分为两类：一类基于核酸杂交原理，以RNA印迹、微阵列技术及原位杂交为代表；另一类则基于扩增原理，有实时荧光定量PCR、恒温滚环复制、新一代测序技术等。其中微阵列技术、RNA印迹技术及实时荧光定量PCR技术最为常用。微阵列技术[2]是对miRNA进行大规模初筛的首选方法，它可以在非常短的时间内完成整个人体基因组的分析，高通量的检测效率是其最大的特点和优势。RNA印迹（Northern blot）可同时显示miRNA的分子量和表达量的具体信息，是最经典最可靠最常用的miRNA检测技术[3]，一般新方法的推广和使用都需要此法加以鉴定和验证,但是所需样本量大、实验过程步骤繁琐、灵敏度低、多个探针易于目标miRNA分子发生交叉反应、检测线性范围窄。原位杂交技术的优点是能够显示miRNA表达的位置，尤其适用于病理组织样本，但该技术提供的miRNA定量信息量很少，也缺少miRNA序列的信息。要想从低至pg的样本中检测到miRNA的存在还是依赖于灵敏度高特异性好的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技术。采用qPCR技术检测miRNA根据引物设计原理不同又可分为两类，RNA加尾和引物延伸法和茎环逆转录引物法[4,5]。前者通过加尾反应从而延长反转录产物cDNA的长度，引物设计和反应体系都较为简单，对同时检测多个miRNA分子尤为适用。后者则使用5'端为特殊茎环结构的逆转录引物，与miRNA结合时不与茎环序列严格配对的miRNA 无法进行反转录,从而实现对目标miRNA分子的特异性筛选，使用这种引物在逆转录后增加了cDNA的长度，克服了miRNA长度短小而难于检测的困难。此法也可用于胞内其他小分子如 siRNA 等的检测，不过茎环法引物设计比较困难，成本高，检测通量低。以上qPCR法信号检测模式有荧光染料和TaqMan探针可供选择。TaqMan探针虽然特异性和灵敏度都好，但针对不同的目的基因都需要单独设计相对应的探针，成本非常高。SYBR Green I荧光染料目前最为常用，能与所有的双链DNA结合，通用性好，但特异性稍差，由引物二聚体、单链二级结构及错误的扩增产物引起的假阳性会影响到定量的准确性。

2 miRNA及其靶位点的SNPs与疾病发生

SNPs即由单个核苷酸发生突变而引起的DNA序列变化。SNPs可发生在初级、前体以及成熟miRNA序列中，而miRNA与其靶基因mRNA的结合位点也存在一定数量的SNPs。这些SNPs均可通过影响microRNA对靶基因的调控过程从而在许多疾病的发生发展过程中扮演重要角色。

2.1 miRNA及其靶位点的SNPs与肿瘤

有研究发现，Pre-miR-146a序列中第+ 60位rs2910164中存在G-C转换，此突变导致miR-146a表达水平显著下降/升高随后负反馈上调/抑制TRAF6、IRAK1以及PTC1等靶基因的表达进而参与了乳头状甲状腺癌（多数见于GC基因亚型、患者miR-146a表达量下降）及家族性卵巢癌（多数见于CC基因亚型，患者miR-146a表达量升高）的发病机制[6]。有研究发现hsa-miR-196a中的rs11614913 SNP位点其C/C与C/T和T/T基因型相比，可作为肺癌早期诊断及预后评价的遗传标记物[7]。Tchatchou等[8]证实位于雌激素受体1中的SNP（rs2747648），其等位位点T通过降低与miR-453的结合程度而引起雌激素受体1过度表达，这极有可能是乳腺癌发病的重要因素之一。Yang等[9]认为位于GEMIN3基因miRNA结合位点的 SNP （rs197414）不但参与了膀胱癌的发病过程，而且CC型和CA型个体罹患膀胱癌的机率更高。

2.2 miRNA及其靶位点的SNPs与其他疾病

存在于hsa- mir-196a2的rs11614913（C＞T）SNP位点与扩张性心肌病的发病有密切联系[10]。Martin等[11]和Sethupathy等[12]几乎同时报道，I型血管紧张素II受体（AT1R）第 1 166位点存在SNPs，其碱基A向 C的突变将会影响miR-155与靶基因AT1R mRNA的结合程度进而导致AT1R过度表达，由此增强了血管紧张素II的生物学功能，这极有可能是高血压、心肌梗死等许多心血管疾病的发病机制之一。有报道IRAKI rs3027898多态性与类风湿性关节炎关系密切。成纤维生长因子20基因rs12720208位点C/T多态性可显著增加帕金森的发病风险[13]。此外还有报道图雷特氏（Tourette's）综合症以及注意力缺陷多动障碍（ADHD）及强迫障碍（OCD）患者第13号染色体上SLITRK 1基因的SNPs的发生可导致miR-189过度发挥其调控功能使得SLITRK 1表达量显著降低，进而引起神经元树突形成不良，由此增加了Tourette's综合征等神经系统疾病的发病风险[14]。

3 miRNA与疾病诊断

虽然组织/细胞miRNA的异常表达对于疾病的诊断、预后及治疗都有十分重要的临床意义，不过对于组织/细胞miRNA，标本的获取有一定的创伤性，并且来源有限无法进行连续检测和随访，因而人们又将焦点转向对体液miRNA的研究中。体液miRNA即细胞外游离状态的miRNA，主要存在于人的血液及尿液等体液中。目前体液miRNA的来源尚未清楚，据推测其有可能随着破碎的组织细胞被动漏出，或者先被包裹在微小体（microvesicle）及外泌体（exosome）中随后再由患病组织细胞分泌后主动进入体液循环，在某些病理状态下呈现特异性改变。

3.1 病理状态下血清/血浆miRNA的变化

Lawrie等[15]首次证实在血清/血浆中可以检测到一定数量的miRNA。随后Chen等[16]报道，血清/血浆miRNA含量也十分稳定，可抵抗RNA酶的降解，也能够耐受强酸、强碱、煮沸、反复冻融等各种极端条件，并进一步通过反复实验发现let-7a、miR-192及miR-25等大多数miRNA分子在血清和血浆标本中的表达量及表达谱都具有高度一致性，不过血清miRNA与血细胞的相关系数更高。不同的肿瘤患者体内存在不同的血清/血浆miRNA分子，并且这些血清/血浆miRNA的表达量与正常健康人也有明显差别，这些均提示血清/血浆miRNA作为新一代无创性分子标志物的可能性。

3.1.1 肿瘤血清/血浆miRNA的变化

肿瘤患者血清/血浆miRNA的特异性改变可为临床提供多种疾病相关信息[16～24]：（1）肿瘤的早期或预后判断：血清miR-25和miR-223可作为非小细胞肺癌的新一代生物学标志物，血清miR-496、miR-30d、miR-1及miR-499与非小细胞肺癌患者生存期密切相关。肝癌患者血清miR-500表达量明显升高，术后降至正常，而血浆miR-92a的变化则与血清miR-500相反，提示miR-500和miR-92a对于肝癌的诊断和预后有重要的临床意义，血浆miR-17-5p、miR-21、miR-106a及miR-106b对于胃癌有着极高的诊断价值，并有望用于胃癌预后判断。血浆miR-210和miR-196a在胰腺癌中呈过度表达，已被证实可辅助临床用于胰腺癌的诊断和预后。（2）用于肿瘤良恶性鉴别：血清miR-21、miR-141和miR-200等8种miRNA其含量的增加与卵巢癌恶性程度一致，而良性卵巢癌上述miRNA分子表达水平极低。（3）辅助判断肿瘤的病理分型及分期：血浆miR-205在非小细胞肺癌的鳞癌中表达水平显著升高，有助于非小细胞肺癌的鳞癌与腺癌分型。血浆miR-31的表达量在直肠癌IV期和II期有明显不同。（4）区分疾病亚型：与乳腺癌组织孕酮受体阴性患者相比较，孕酮受体阳性患者血清miR-156呈过度表达，而乳腺癌雌激素受体阳性患者血清 miR-10b和miR-21的表达水平与雌激素受体阴性患者相比则明显降低。

3.1.2 心血管疾病血清/血浆miRNA的变化

由于心脏组织标本通常很难取得，故而临床诊断主要依赖于血清学标志物的应用。现已发现miR-133a、miR-499、miR-1和 miR-208a在正常健康人血浆中浓度极低甚至检测不到，而在AMI时上述四种miRNA分子表达水平显著上调，并且几乎所有AMI患者出现典型临床症状4 h后都可检测到血浆miR-208a的存在，与肌钙蛋白（cTnT）诊断灵敏度相当，miR-1还可作为反映疾病严重程度以及监测药物治疗效果的有效指标[25]。另有研究报道[26]miR-499仅来源于心脏组织，且在AMI患者血浆中表达水平显著高于充血性心力衰竭患者和无心血管疾病患者，提示miR-499可特异性反映心肌损伤程度，是AMI患者较好的预测标志物。最近又有报道[27]使用由miR-142-5p、-498、-492、-1281、-151-5p、-802、-455-3p、-1250、-345等20个miRNA分子组成的独特签名（miRNA sinature）对AMI诊断准确性、敏感性、特异性分别高达93%、90%、96%。心力衰竭时血循环miRNA也会发生特性改变，有报道[28]血浆miR-423-5p的升高不仅可辅助临床进行早期诊断，并且其表达水平与脑尿钠肽（Brain natriuretic peptide，BNP）以及心功能分级呈显著正相关，提示其有可能参与了心衰的发病过程。

3.1.3 糖尿病血清/血浆miRNA的变化

Chen等[16]发现血清 miRNA的特异性变化比血浆miRNA更能准确地反映2型糖尿病的患者病情。而最新又有报道[29]糖尿病患者血浆miR-15a、miR-29b、miR -126、miR-233和miR-28-3p的表达失调早于典型临床症状表现，提示这些血浆miRNAs也可对糖尿病进行筛选和诊断，并能够作为评价疾病转归的预测指标。

3.2 病理状态下其他体液miRNA的变化

继血清/血浆miRNA分子被发现以后，随后人们在脑脊液、唾液、痰液、尿液、胸腔积液等人的其他体液中也检测到了miRNA的存在，并且含量同样稳定，而某些体液miRNA同血清/血浆miRNA一样也可构成疾病的指纹，有良好的临床应用前景。

3.2.1 阿尔茨海默病脑脊液miRNA变化

Cogswell等[30]报道有201 种 miRNA存在于阿尔茨海默氏痴呆患者脑脊液中，其中60种在5期和1期患者中的表达水平有明显差异， 并且miR-146b和miR-142等在5期患者脑脊液中的表达量显著下降，提示这些异常表达的miRNAs可辅助临床确定阿尔茨海默病的病理分期。

3.2.2 口腔鳞状细胞癌（OSCC）唾液miRNA变化

OSCC是头颈部的恶性肿瘤之一，容易发生扩散和淋巴结转移，大多数患者确诊时已经失去最佳治疗时机，所以早期发现并确诊对OSCC来说尤为重要，唾液miRNA的发现则为OSCC诊断带来了新的光明前景。Park等[31]通过大量实验证明，无论是唾液还是经过处理的唾液上清液中都可检测到一定数量的miRNAs,不过表达谱略有差异，提示这有可能与脱落的口腔上皮细胞不同有关。唾液miR-200a、miR-125a、miR-93及 miR-142-3p在 OSCC患 者 中表达水平呈显著下调，进一步构建ROC曲线进行分析，结果显示miR-200a和miR-125a 曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为0.65和0.62，具有更高的诊断价值。另外，唾液miR-31和血浆miR-31一样对于OSCC的早期筛选意义重大。

3.2.3 肺癌痰液miRNA变化

Xie等[32]最新报道肺癌中痰液miR-2l表达水平呈明显上调，诊断价值比痰液细胞学检查还要高。而且，痰液特定miRNA表达谱还有助于肺癌的病理分型，利用痰液 miR-205、miR-210、miR-708和 miR-21、miR-486、miR-375、miR-200b 可分别对鳞状细胞肺癌和肺腺癌进行早期诊断。由此可见，检测痰液miRNAs为肺癌早期筛选以及鉴别诊断提供了一种无创并且快速的新方法。

3.2.4 膀胱癌尿液miRNA变化

由于泌尿系统各组织或者器官分泌物都要通过尿液排出体外，因此对尿液中异常物质的检测可实现对膀胱癌等泌尿系统疾病的普遍筛查和早期诊断。Hanke等[33]在他们的研究中发现，miR-126、miR-182和miR-199a在膀胱癌患者尿液中呈过度表达，miR-126和miR-182组合在一起ROC曲线显示其AUC为0.768，诊断价值高，miR-126与miR-152的比值则有助于膀胱癌以及低分期原位膀胱癌的诊断，而miR-182与miR-152的比值对晚期膀胱癌诊断效果更佳，以上结果均表明尿液 miRNA 含量的变化可以成为监测膀胱癌病情发展的新一代生物标志物。

此外，还有报道胸腹水上清液中miR-24及miR-30d与药物敏感性有关，并且可用于胸腹水良恶性的鉴别诊断。而在人体乳汁及精液等体液中[34]也存在一定数量的异常miRNA分子，但它们是否可用于疾病的诊断，这还有待进一步研究并阐明。

4 miRNA与疾病治疗

当前miRNA应用于肿瘤治疗主要有三种途径：（1）对有类癌基因作用的miRNAs如miR-155、miR-372和miR-373，可通过引入沉默miRNA互补片段即抗miRNA寡聚核苷酸（Anti-miRNA oligonucleotides，AMOs）、锁定核酸修饰的寡核苷酸（LNA-modified oligonucleotide）及miRNA拮抗分子 （antagomirs）等通过抑制其生物学作用而达到治疗疾病的目的，此方法毒性低、副作用小并且稳定性高[35]。（2）利用病毒或者脂质体组成的表达系统引入let-7和miR-15a/16等肿瘤抑制基因miRNAs使其呈过度表达，进而发挥强大的抑癌作用[36]。（3）对于已经鉴定的组织/细胞miRNAs，可根据药物作用前后其表达特点来制备个性化治疗方案。如肝癌患者细胞miR-122表达量的显著下降与化疗药物阿霉素发生耐药显著相关，提示实时检测miR-122的表达水平可为评估药物化疗效果提供了一种新的方法。miR-26在某些肝癌患者体内呈持续性低表达，而研究表明此类患者更适宜干扰素治疗。乳腺癌患者miR-328可以用来判断机体对药物米托蒽醌的敏感性和耐药性。

此外，研究证实miR-146a作为调节分子参与了系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）I型干扰素通路的异常激活，调节患者体内miR-146a的表达量，为SLE提供新的治疗手段[37]。最新又有报道miRNA与丙型肝炎病毒及I型灵长类泡沫病毒关系密切，提示深入研究miRNA在病毒中的表达变化与特点，可为临床带来新的抗病毒治疗方案。

5 问题和展望

虽然当前对miRNA及其与医学相关的研究都已经取得一定进展，但仍有许多迷团有待于探索和解决。例如，miRNA有关SNPs的具体发生部位?SNPs如何影响miRNA 和 mRNA的相互作用？循环miRNA的来源？循环miRNA作为生物标志物应用于临床还存在很多问题（检测方法的准确性和灵敏度、研究病种的全面性、病例数量的有限性等）怎样解决和完善？miRNA作为治疗性药物又如何从理论研究转为临床实践？我们相信随着这些问题的解决，miRNA将为生命科学、遗传学以及临床医学等领域带来一场新的革命。

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