慢病毒载体——重组蛋白高效表达的新契机

周鹏高洋杜红延★李红卫★

慢病毒载体
——重组蛋白高效表达的新契机

周鹏1高洋2杜红延2★李红卫2★

随着生命科学产业的发展，人们对于重组蛋白的需求越来越大，所以构建一种能够大规模生产重组蛋白的系统成为当前的研究热点。而通过慢病毒（Lentivirus）来提高重组蛋白的产量可能会是一种十分有效的方法。由于其拥有的优良特性，慢病毒系统被广泛关注，已经被应用于许多领域。本文对近年来有关慢病毒系统在外源重组蛋白表达方面的应用进行了综述。将慢病毒应用于外源重组蛋白的表达，将会为外源蛋白的高效表达提供新的契机。

慢病毒；慢病毒载体；高效表达

1 慢病毒载体

慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）是指来源于人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV），并在此基础上发展的一种基因操作病毒载体。将人类免疫缺陷病毒进行基因改良并用于转基因的研究已经超过了20年。早期的HIV经过持续改进，目前已发展成为安全、有效的慢病毒载体。慢病毒载体现已被广泛应用于基础生物学的很多领域：转基因，重组蛋白过表达，持久性的基因沉默，免疫学，体内成像，转基因动物，诱导多能细胞，干细胞修饰，谱系追踪以及定点基因剪接等[1]。

慢病毒是一种逆转录病毒，使用逆转录酶（reverse transcriptase，RT）和整合酶（integrase，IN）可将自身的病毒基因信息稳定的插入宿主基因组。慢病毒有自己特定的宿主，例如人类、猴子、猫、马、牛、山羊和绵羊，对于不同物种有不同的特性、受体和致病性。慢病毒常能导致慢性疾病，例如免疫缺陷、贫血、肺炎、脑炎[2～5]。该病毒属除了HIV外还有猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）、马传染性贫血（equine infectious anemia，EIA）和猫免疫缺陷病毒（feline immunodeficiency virus，FIV）。与其他逆转录病毒不同，慢病毒不仅能感染分裂细胞，还能感染非分裂细胞并进行复制[6]，因此改良的慢病毒系统已经成功应用于各种类型细胞，如神经细胞、肝细胞、视网膜细胞、树突状细胞、肌细胞、胰岛细胞等[7～12]。

同时作为一种转基因载体，慢病毒有很多优良特性：（1）能与宿主基因组稳定整合，从而获得持久性的基因转导；（2）对于分裂细胞和非分裂细胞都有感染能力；（3）广泛的组织嗜性。包括一些基因治疗和细胞治疗的靶细胞；（4）在转导之后不会表达病毒的蛋白质，细胞毒性小，宿主细胞免疫反应小；（5）能够转导复杂的遗传因子,如多顺反子和基因内区包含序列；（6）整合位点的安全性可能更高；（7）载体的操作和生产相对容易[1,13]。

由于大多数的慢病毒载体都是基于HIV-1，所以这里就以HIV-1为例来介绍慢病毒载体的一些基本信息。HIV-1基因组是两条相同的正链RNA，每条长约9.2～9.8 kb。其中最大的三个开放阅读框架（Gag，Pol和Env）编码了它最主要的结构蛋白：Gag编码病毒核心蛋白，Pol编码病毒复制所需要的酶，Env编码病毒表面糖蛋白gp160。gp160可以裂解为gp120和gp41，这两种蛋白对于HIV-1感染CD4细胞是必不可少的[1,14]。到目前为止，慢病毒载体已经发展了四代，从第一代的安全性低并只能感染CD4细胞的载体，到第四代的安全性高、无组织选择性的可调控性慢病毒载体[1,13]。研究者对新一代慢病毒的改良研发工作仍在进行，相信其前景十分广阔。

2 慢病毒载体表达重组蛋白质的高效性

随着基础研究以及临床应用的发展，作为许多药物主要成分的重组蛋白需求量日益增多。但是，长期以来利用真核表达系统快速大量表达重组蛋白的技术仍是一个科学性难题。

最常用的重组蛋白原核生产系统是大肠杆菌（E.coli），它简单、快捷、成本低而且能够满足大多数需要。然而原核系统在生产真核细胞的蛋白质时，存在严重的局限性。例如细菌表达系统没有能力执行转录后修饰的折叠、糖基化、磷酸化，导致其产物生物活性不足[15,16]。此外重组蛋白的真核细胞表达系统也会使用真菌和昆虫细胞，真菌系统在产量方面较细菌有优势，且能成功表达复杂蛋白质，甚至还能部分表现出翻译后修饰，但糖基化等修饰却和哺乳动物不同[17,18]。同样，昆虫细胞也不能准确的表达复杂的哺乳动物蛋白的糖基化[19]。因此，用于生物研究的重组蛋白最好是由哺乳动物细胞系生产，现在最常用的是啮齿动物细胞和人体细胞，比如中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO），幼仓鼠肾细胞（baby hamster kidney，BHK），人胚肾细胞（human embryonic kidney，HEK）293。大约70%商业化生产的重组蛋白来自于CHO[20]，因为CHO有着出色的适应性以及遗传可塑性[21,22]，而且CHO细胞可以在无血清培养基中悬浮培养到非常高的密度，从而能够在生物反应器中扩大增殖[23]。Gaillet等[24]在实验室开发出一种基于腺病毒感染的新方法，用于改善在CHO细胞瞬时表达的重组蛋白产量，在非最佳条件下，他们所用的腺病毒系统可以生产高达65 μg/mL的分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）。虽然CHO细胞的应用已十分广泛，但也不够理想，因为其表达的产物可能成为过敏原从而引起临床副作用，而且生产水平也通常低于HEK293细胞[25～29]。

慢病毒能够感染各种分裂和非分裂的细胞，并且能有效稳定整合到宿主细胞的基因组染色体，使用慢病毒来转导目的基因为外源蛋白的高效表达提供了新的思路。与其他载体相比较，慢病毒载体拥有较高的转导效率与基因表达效率。HIV-1在逆转录的过程中，正链DNA是从中央多嘌呤序列（central polypurine tract，cPPT）开始合成的。有研究表明，在慢病毒载体中引入顺式作用的cPPT，可以有效提高慢病毒载体的转导效率[30]。另外一种顺式作用元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件 （woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element，WPRE）。WPRE可以增加细胞核与胞浆的未剪接RNA浓度，所以在慢病毒载体中引入WPRE可以显著增强目标细胞中外源基因的表达[31]。可是WPRE含有截断的土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHV）X基因，这有可能导致动物发生肝癌[32]，但通过对X基因的开放阅读框架的突变，WPRE的安全性得到很大的提升[33]。

Gaillet等[34]利用慢病毒与CHO构建一个能够快速大量生产重组蛋白的系统，使蛋白产量达到了毫克水平并证明了此系统的有效性。在对初始浓度为1.5×106cells/mL的CHO-Cum2细胞系的转导之后，重组蛋白的产量可以达到160～235 μg/mL，这在CHO细胞没有浓缩和复制的情况下是一个相当高的产量。随着CHO细胞培养的改进，可以设想此系统在细胞初始浓度高于107cells/mL时，其重组蛋白的产量可以达到1 mg/mL，并且他们也验证了此系统生产的蛋白质序列没有明显的改变，该系统的主要限制是需要高滴度的慢病毒载体。

研究中还发现，慢病毒的包装大小存在限制性，只有在10 kd DNA左右有效率，否则已整合的慢病毒就存在着基因沉默的可能性。针对这个问题，Bandaranayake等[35]在他们设计的重组蛋白质表达系统（Daedalus）中，通过构建一个0.7 kd的染色质开放元素（ubiquitous chromatin opening elements，UCOE）并导入了慢病毒载体，将慢病毒的包装大小稳定的提高到了接近70 kd。Daedalus系统是由慢病毒载体与293-F细胞组成，使用分泌途径生产，从而使初始转导率更有效，并大大降低了纯化蛋白质的难度。他们在传统的100 mL规模的培养基中，以5×105cells/mL为初始浓度，表达出12种蛋白质，其表达量在20～100 mg/L之间，而且所产生的蛋白质只需要一步层析法就能快速方便的纯化。

3 慢病毒载体在疾病治疗方面的应用

有些疾病是由体内某种蛋白质表达不足或者错误表达所引起的，如果把慢病毒应用于高效表达这些蛋白质，将会给这些疾病的防治带来很大的益处。

3.1 在造血系统疾病的应用

血友病A是由凝血因子VIII缺乏所引起的，是临床上最常见的血友病。目前已有使用慢病毒载体高效表达人类重组凝血因子VIII的报道，Spencer等[36]使用BHK细胞来表达凝血因子VIII，最终可使速率达到每天每细胞表达9 pg，表达总量达到2.5 mg/L。而且所产生的蛋白质结构一致并在血友病小鼠体内证明有效。除了表达效率高之外，他们还有效降低了产物的免疫原性，延长了半衰期。da Rosa等[37]使用慢病毒表达载体在人肝癌细胞株中成功表达重组凝血因子VIII，使凝血因子VIII的产量达到了每天1.5～2.1 IU/106cell，并也在血友病小鼠体内证明了产物的有效性。他们的研究为血友病的治疗提供了一个新的机遇。

3.2 在心血管系统疾病的应用

动脉粥样硬化与高血脂关系密切，而使用慢病毒降低血脂也有报道。在2008年一篇报道中，研究人员将携带载脂蛋白（apolipoprotein，Apo）AL的慢病毒载体对造血祖细胞与巨噬细胞进行体外转导，然后移植入apoE-/-的小鼠体内，结果不仅提高了表达量，还能使动脉粥样硬化的损害区域降低50%[38]。另外也有一篇使用慢病毒与泡沫细胞表达脂联素的报道，表明脂联素可以有效降低氧化低密度脂蛋白（oxygenized low density lipoprotein，oxLDL）的摄取，提高高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）介导的胆固醇外流，从而可以有效防控动脉粥样硬化，研究人员通过慢病毒感染人类泡沫细胞来高效表达脂联素，结果成功的减少了脂肪堆积[39]。

3.3 在神经系统疾病的应用

Tau蛋白在阿尔茨海默症（Alzheimer disease，AD）发病中有重要作用，Caillierez等[40]使用慢病毒向大鼠的海马体转导六种人类Tau蛋白基因，利用大量表达出的Tau蛋白制作出不同的神经元纤维变性的模型，使AD的研究又前进了一步。帕金森病（Parkinson's disease，PD）的一个主要病理改变是黑质多巴胺能神经元的变性死亡，而神经胶质细胞源性的神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）可以保护黑质多巴胺能神经元，Georgievska等[41]在大鼠纹状体中使用慢病毒载体转导并高效表达GDNF，能使黑质多巴胺能神经元的损害降低65～77%，为PD的相关研究以及治疗提供了有价值的结果。

3.4 在内分泌疾病的应用

侏儒症是由生长激素缺乏所引起的，有人曾构建可以有效的表达人类生长激素（human growth hormone，HGH）的慢病毒载体，通过感染小鼠的成肌细胞，最终使持续表达的时间达到了8周以上，成功让他们的载体可以长期持续地表达[42]。有研究表明胰岛素作用于大脑中央杏仁核可能会引起厌食反应[43]，Park-York等[44]使用慢病毒在大鼠杏仁核转导蛋白激酶（proteinkinases，PK）Cθ，使PKCθ过表达，他们发现PKCθ可以降低胰岛素对杏仁核的敏感性，从而改善胰岛素所引起的厌食反应。

3.5 在其他方面的应用

Martignani等[45]在他们的牛乳腺上皮干细胞中使用慢病毒转导人类β-酪蛋白，也获得一定的产量。另外，对于慢病毒可以减少基因毒性的特性也有报道，Lachmann 等[46]使用慢病毒在体内表达胞嘧啶脱氨酶，可以降低其对骨髓的毒性。

4 总结与展望

对于重组蛋白质与日俱增的需求量促进了相关科学研究的进步，但目前的方法都难以真正满足需求。所以重组蛋白生产系统的产量可谓是多多益善，这也意味着此项研究还远远没有走到尽头，仍有很长的路需要探索。而重组蛋白的产量越大，意味着产生蛋白质的成本越低，将为临床和科研带来潜在的经济效益。因此，探索提高蛋白质产量的方法在今后很长一段时间内仍将是科学研究中很有价值的一部分，而因为拥有许多优良特性，慢病毒载体可能会成为提高重组蛋白质产量的一种有效方法。

作为一种新型病毒载体，慢病毒比起其他载体有许多明显的优势，越来越多的研究开始使用慢病毒作为其转基因的载体。随着相关生物产业的发展，现今已可以购买到随时可用的慢病毒，使用更加方便。由于能够携带复杂的外源基因，所以将慢病毒载体用于表达复杂的治疗性蛋白质很有临床意义。甚至可以设想利用慢病毒表达率高，表达准确，表达持续时间长等优势直接进行体内转导，采用基因治疗方式来治疗某些疾病，可能会是一种一劳永逸的方法。可以预见，慢病毒载体的应用将会更加广泛。

然而，慢病毒仍有一些不足。例如对插入外源性基因的大小依然存在限制性，难以表达大型蛋白质；虽然慢病毒的免疫原性较小，但仍有可能在体内引起免疫反应[47]，而且慢病毒也有可能激活宿主细胞的Toll样受体（toll-like receptors，TLR）9基因，这也限制了慢病毒在临床方面的应用[48]；甚至存在着表达出无活性产物的可能性，Geering等[49]在他们的研究中发现使用中性粒细胞与慢病毒载体表达出的死亡相关蛋白激酶（death associated protein kinase，DAPK）2在细胞中没有活性。此外还有一点需要指出，慢病毒载体是由致病的病毒改造而来，尽管慢病毒载体的安全性得到极大的提升，却仍然不能完全排除产生可复制病毒的可能性。随着研究的深入与方法的改进，慢病毒的缺陷也正在逐渐改善，因此，对于慢病毒载体的改进也会是一项有前景的研究。

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Lentiviral vectors: a new opportunity of high-level recombinant protein expression

ZHOU Peng1, GAO Yang2, DU Hongyan2★, LI Hongwei2★
(1.The First Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China; 2.School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

The demand for the recombinant protein is increasing with the development of life science industry and it is a current research hotspot to build a system which can produce high-level recombinant proteins. And it could be a very effective method to improve the production of recombinant protein by the application of lentiviral vectors. Because of several excellent properties, the lentiviral vectors have been widely used. We review the recent applications of recombinant protein expression by using lentiviral system. And the lentiviral vectors would provide a new opportunity to express high-level recombinant proteins.

Lentivirus; Lentiviral vector; High-level recombinant protein production

国家自然科学基金（81072113）；国家863项目（2012AA020205）；生物安全国家重点实验室开放课题（SKIPBS1103）；南方医科大学基础研究前期启动项目（B1012076）

1.南方医科大学第一临床医学院，广东，广州 510515 2.南方医科大学生物技术学院，广东，广州 510515

★通讯作者：杜红延，李红卫，E-mail:gzduhongyan@126.com

注：杜红延，李红卫为共同通讯作者