细胞凋亡在牙齿发育中的研究进展

许 姗 陈贵妙 林陈胜 福建师范大学生命科学学院 福州 350108

细胞凋亡（apoptosis），是多细胞生物体调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。细胞凋亡一词提出至今已有40多年。随着细胞生物学、遗传学、分子生物学等相关学科的发展，对其分子机制的认识有了更深入的了解，细胞凋亡已逐渐成为生命科学的研究热点。

长期以来，细胞凋亡往往又被称为程序性细胞死亡（programmed ce11death，PCD），两种名称经常被混淆使用，而事实上，两者的涵义是不同的。PCD是机制上的概念，用于描述发生于各生物种系胚胎发育过程中的正常细胞死亡的所有表型，具高度可遗传的时序性和空间性，即细胞在发育的特定阶段按序死亡。而细胞凋亡是形态学的概念，是对多种方式引起的一种特征性形态和生化改变的概括。它并非代表引起细胞死亡的过程和路径而是指众多因素造成的众多死亡途径的最终表现。

早在19世纪，发育生物学家就发现无论是胚胎发育过程中，还是胚后发育，均存在细胞的死亡现象。细胞凋亡机制已经包含在许多精细的组织器官胚胎发育中，如肾脏、心脏、神经系统、上皮组织等，它通过控制细胞数目和组织形状，在器官形态发生和形成时起重要作用［1］。

1 牙齿发育中的细胞凋亡

哺乳动物牙齿发育是由外胚层来源的上皮细胞和颅神经嵴来源的间充质细胞共同分化而来的，其中牙釉质由上皮细胞分化形成，牙本质、牙髓等其他结构是由间充质细胞分化形成。在组织形态学上，人类的牙齿发生与小鼠的磨牙发生极为相似［2］。在小鼠中，牙齿发生的定位是在胚胎发育的E10.5（胚胎龄第10.5 d）［2］。哺乳动物的牙齿发育均会经历一系列上皮增厚的过程：牙板期、牙蕾期、帽状期和钟状期，同时伴随着牙釉质的分泌矿化［3］。牙齿的形态发生是在特定时空所发生的由诸多相关基因严格调控的一系列生理过程，包括细胞增殖、细胞凋亡的抑制或刺激、细胞周期调节等［4］。

牙齿作为研究哺乳动物器官发育的一个模型，其细胞凋亡已有大量研究。研究发现，小鼠牙胚发育中存在着细胞凋亡现象，提示细胞凋亡在牙齿发育中有重要作用［5］。同时，应用TUNEL技术研究小鼠牙胚发育过程中的细胞凋亡，发现细胞凋亡参与了牙上皮与牙间充质的相互作用，调控牙尖、牙颈及牙根的形成，发挥塑形作用［6］。

细胞凋亡最早发生在蕾状期，表明细胞凋亡参与了牙蕾结构的形成［7］。帽状期，细胞凋亡位于原发性釉结节（Primary ename1knot）中。随着牙胚发育进入钟状期，细胞凋亡又在继发性釉结节（Secondary ename1knot）中出现。这一结果表明，釉结节在完成其诱导牙尖形成的功能后，通过细胞凋亡机制而被清除。用体外重组实验研究，证实细胞凋亡在牙胚发育中的作用。将E13小鼠牙胚的上皮与间充质分离后分别进行体外培养，结果发现在上皮和间充质中均有凋亡细胞。当两者共培养时，在两个组织接触的区域细胞凋亡受到明显抑制。这个结果表明上皮与间充质的相互作用可以抑制细胞凋亡。将成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）加入培养体系中，发现其能明显抑制间充质的细胞凋亡。因此，信号因子的作用会影响上皮与间充质的相互作用，最终可能导致细胞凋亡［5］。

小鼠磨牙牙胚中，原发性釉结节参与了牙齿从蕾状期向帽状期的转变过程［8］。牙胚发育至帽状期，凋亡细胞主要集中在内釉上皮凹面中心区域（即原发性釉结节）。随着牙胚发育至钟状期，研究证实继发性釉结节决定着未来牙尖的位置，调节牙胚形状，尤其是牙尖形成的信号调控中心［9］。原发性釉结节与继发性釉结节均表达了一系列的信号分子，如Fgf-4，参与了细胞凋亡［9］。随后，有研究发现存在着第三种釉结节，出现在靠近牙尖无釉质分泌的区域，研究认为其对于调控釉质的沉积有重要的作用［10］。Mata1ova等利用激光捕获显微切割技术，将原发性釉结节分离培养细胞，研究结果表明，此类细胞是研究牙齿发育中细胞凋亡的分子机制的一类重要的细胞［11］。已有超过50种基因被证实在釉结节中有显著表达，如 Shh、Bmp-2、Bmp-4、Bmp-7、Fgf-4 等［12］。釉结节在完成其诱导牙齿发育及其信号调控作用后，通过细胞凋亡机制而被清除。

2 牙齿发育中细胞凋亡相关因子

发育中的细胞凋亡，是在许多基因调控下发生的生理性现象，其中Caspases和Bc1-2基因家族等是重要的细胞凋亡相关因子。

2.1 Caspases Caspases（cysteiny 1 aspartate-specific proteases），是一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，能够特异地切割天冬氨酸残基后的肽键，是一类与凋亡密切相关的蛋白水解酶家族，该家族成员按其发现先后分别被命名为Caspase 1-14。Caspases-3是Caspases家族中最主要的凋亡执行者之一，可促进凋亡，并被Bc1-2阻止。在牙胚中Caspases-3阳性细胞与Tune1阳性凋亡细胞分布一致，表明在牙齿发育期细胞凋亡可能是由于激活了 Caspases家族［13-14］。

利用 Caspases-3突变鼠（knock-out）研究 Caspases-3在牙齿发育中的功能［15］，发现在突变鼠的原发性釉结节中检测到细胞凋亡的存在，第一磨牙有暂时性的改变。然而，这些形态学的变化在随后的发育过程中都得以补偿，最终形成正常的牙齿形态。因此，Caspases-3虽然参与了牙齿的细胞凋亡，但是似乎不是牙齿形成所必须的。在牙齿发育早期，特别是在原发性釉结节中，Caspases-3的缺乏并不会影响最终恒牙的结构、形态和组织分化。

在Caspases-9和Apaf-1突变鼠中，在原发性釉结节中并未发现有细胞凋亡［16］。与Caspases-3突变鼠不同的是，Caspases-9和Apaf-1突变鼠在钟状期并未发生形态学上的变化。虽然在原发性釉结节中没有检测到细胞凋亡，但是从帽状期到钟状期的转变与野生型小鼠的表型一致。因此，认为这种放大机制，特别是通过凋亡受体作用，是线粒体与Caspases之间连接进行协同作用，从而启动细胞凋亡［17］。

有研究报道利用磨牙离体培养检测Caspases（半胱天冬酶）的抑制作用［18］。在E13.5小鼠磨牙的离体培养中，通过药物抑制Caspases的活性，发现其形态上并未有明显变化。由于Caspases被抑制细胞没有发生凋亡，釉结节依然存在并未消失。同时，在存留的釉结节中，Shh、Msx-2、Bmp-2、Bmp-4 等基因的表达下调，表明釉结节中信号的缺失能够引起其本身不被消除。因此，细胞凋亡的缺失，不会影响牙齿形态的形成。细胞凋亡的作用可能仅仅只是清除停止生长的细胞，而不是抑制釉结节发挥其信号调节作用。然而，运用Caspases抑制剂干扰早期牙齿发育，却发现牙齿的形态最终被改变，因此，釉结节中发生的细胞凋亡对于牙齿正常的形态和大小也是必要的［19］。关于釉结节中所发生的细胞凋亡的准确作用，仍然需要进一步的研究证实。

2.2 Bc1-2/Bax Bc1-2是从滤泡性淋巴瘤中分离出的一种原癌基因［20］。已知Bc1-2通过控制核内外物质的运输、抑制Ca2+的释放或阻断细胞内外过氧化物的堆积而抑制细胞的凋亡。而Bax基因是第一个分离到的Bc1-2同源基因，可与Bc1-2形成异源二聚体（Bc1-2/Bax）从而拮抗Bc1-2抑制细胞凋亡的作用，是一种凋亡相关基因。Bc1-2与Bax所形成的异源二聚体中两者的比例决定细胞到底该向存活还是死亡的方向发展［21］。

Bc1-2在牙齿发育的早期表达较强，在牙体组织形成后表达下调［22］。在成釉细胞中也检测到Bc1-2的表达［23］。表明Bc1-2基因在牙齿形态形成过程中，是调控细胞增殖、分化、成熟、消亡的重要因素。

有研究发现，大部分牙胚细胞均同时表达Bc1-2和Bax［24］。Bax在外釉上皮中表达更强，而在内釉上皮中Bc1-2表达更强。星网层中，有一些细胞仅单一表达Bc1-2或者Bax，也有一些两者同时表达。间充质中大部分只表达Bax。利用转基因小鼠在成牙本质细胞中过表达Bc1-2，研究发现过表达Bc1-2会导致牙齿发育过程的异常，成牙本质细胞凋亡受抑制［25］。然而，虽然成牙本质细胞的增殖率或死亡率均受到了影响，但突变鼠与野生鼠中成牙本质细胞的密度并未发现明显变化。成牙本质细胞密度未改变，可能是由于牙髓腔体积的均衡变化（突变鼠的牙髓腔比野生型的大），也可能是由于其他未知的原因，仍需要更深入的研究。

3 结语

细胞凋亡存在于牙齿发育的各个阶段，也已被证实在细胞的增殖和消亡方面有重要的作用，控制着整个牙齿的发育进程。釉结节作为信号中心，其细胞凋亡也对牙齿的形成有重要影响。牙齿发育过程中受到多种自身基因的调控，细胞凋亡的启动和进行源于这些基因的相互作用。实验已初步揭示这些凋亡基因在牙齿发育中的重要影响，但细胞凋亡在发育中的准确作用尚未明确表明。因此，对牙齿发育中细胞凋亡信号分子的深入研究，不仅对于我们认识其发生机制有益，更重要的是对临床诊断及其相关疾病预防和治疗有重大的帮助。

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