姜黄素抑制刺猬信号诱导小细胞肺癌细胞凋亡

刘杏娥

姜黄素抑制刺猬信号诱导小细胞肺癌细胞凋亡

刘杏娥

目的 探讨姜黄素对小细胞肺癌NCI-H446细胞的作用及可能机制。方法 不同浓度（5、10、15μmol/L）的姜黄素作用于小细胞肺癌NCI-H446细胞后，采用MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western blot技术检测索尼克刺猬信号（Shh）、脑胶质瘤相关癌基因1（Gli1）的表达水平。结果 不同浓度的姜黄素与小细胞肺癌NCI-H446细胞共培养后，浓度为15μmol/L的姜黄素能明显抑制NCI-H446细胞的增殖。与其余各组相比，差异有统计学意义（P＜0．01）。小细胞肺癌NCI-H446细胞经姜黄素处理后，姜黄素15μmol/L与其余各组比较，细胞凋亡率的差异有统计学意义（P＜0．01）。经姜黄素（15μmol/L）处理的NCI-H446细胞，Shh和Gli1表达均明显降低，与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0．01）。结论 姜黄素能通过抑制刺猬信号通路，抑制小细胞肺癌细胞的增殖，诱导其凋亡。

姜黄素 小细胞肺癌 刺猬

姜黄素是一种从姜科植物姜黄中提取的酚化合物，具有强烈的抗炎、抗氧化、抗突变等特性。近年来的研究表明,姜黄素可通过多种机制抑制多种肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，诱导其凋亡，并能提高其对化疗药物和放疗的敏感性[1-2]。刺猬信号通路由刺猬配体、两个跨膜蛋白受体patched（Ptch）、smoothened（Smo）以及下游转录因子Gli蛋白等组成。刺猬信号通路在胚胎发育、组织修复及癌症发生等进程中发挥重要作用[3]。近年来研究发现，刺猬通路的异常激活与肺癌的发生、发展关系密切[4-5]。本文通过研究姜黄素对小细胞肺癌SCLC NCI-H446细胞体外增殖、细胞凋亡等影响，同时检测索尼克刺猬信号（sonic hedgehog，Shh）、脑胶质瘤相关癌基因1（glioma associated oncogene 1，Gli1）蛋白表达水平，探讨姜黄素对SCLC细胞的作用及可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料 SCLC NCI-H446细胞购自中科院上海细胞所。姜黄素购自美国Sigma公司。兔抗人Shh、Gli1一抗购自美国Cell Signaling公司产品，鼠抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自联科生物技术有限公司。DMEM、胎牛血清购自美国GIBCO公司。MTT购自美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 姜黄素储备液 称取姜黄素368.38mg溶于无水乙醇40ml中，得姜黄素25mM保存。使用前取0.5ml储备液加0.75mlDMEM培养液制成10mM工作液。

1.2.2 姜黄素抑制SCLC细胞增殖的实验研究 采用MTT法检测细胞增殖抑制率：NCI-H446细胞经DMEM常规培养，0.25%胰酶消化后,以1×104/ml接种于96孔培养板中，37℃过夜。将细胞分为姜黄素5、10、15μmol/L处理组及对照组，培养48h后将96孔板中的细胞以500g离心3min，弃100μl上清液，加MTT 10μl（5mg/ml），37℃孵育4h，加DMSO 100μl，震荡10min后上酶标免疫测定仪检测OD490值。计算细胞增殖抑制率，抑制率=（1-处理组A值/对照组A值）×100%。

1.2.3 姜黄素诱导SCLC细胞凋亡的实验研究 采用Annexin V-FITC/PI双染色法，按试剂盒说明书操作：NCI-H446细胞经DMEM常规培养后用0.25%胰酶消化，以1×105/ml接种于6孔培养板中培养过夜，将细胞分姜黄素5、10、15μmol/L处理组及对照组。经48h处理后胰酶消化收集细胞，800g离心5min，再经PBS洗3次，分别加缓冲液50μl、V-FITC 5μl、PI 10μl，避光5min以上，进行流式细胞检测。

1.2.4 姜黄素对Shh、Gli1表达的影响 采用Western blot技术检测Shh、Gli1的表达水平：NCI-H446细胞经DMEM常规培养后用0.25%胰酶消化,以1×105/ml接种于6孔培养板中培养过夜，将细胞分为姜黄素15μmol/L处理组及对照组，48h后收集各组细胞，一步法裂解细胞后以13 000r/min高速离心10min，取上清液进行蛋白定量。常规制备10%SDS-PAGE分离胶和积层胶。每孔上样蛋白量50μg，加4×上样缓冲液，混匀后煮沸5min，上样后100V电泳至染料跑出胶。轻轻取下胶，用Millipore H2O洗胶1次，100V转膜2h，用封闭液37℃封闭2h，加入相应的一抗（1∶1 000）4℃过夜，TBST洗膜4次，10min/次，加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）室温1h，TBST洗膜4次，10min/次，最后加ECL液曝光显色。结果用Band Leader软件进行条带灰度半定量分析。1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 MTT增殖试验 姜黄素5、10、15μmol/L处理组的NCI-H446细胞增殖抑制率为（14.61±2.94）%、（17.24± 2.91）%、（58.34±4.91）%。随着姜黄素浓度的逐渐增加，NCI-H446细胞的增殖抑制率也逐渐增加，姜黄素5、10μmol/L处理组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），与对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；而姜黄素15μmol/L处理组与姜黄素5、10μmol/L和对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.2 细胞凋亡检测 姜黄素5、10、15μmol/L处理组的NCI-H446细胞凋亡率分别为（3.29±0.26）%、（3.86± 0.33）%及（27.31±1.42）%，对照组为（2.80±0.31）%（图1）。姜黄素15μmol/L处理组较5、10μmol/L处理组及对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 姜黄素抑制NCI-H446细胞Shh、Gli1的表达 见图2、3。

图3 姜黄素15μmol/L处理组、对照组Shh、Gli1的半定量比值对比图（1：姜黄素15μmol/L处理组；2：对照组）

由图3可见，在姜黄素15μmol/L处理组Shh、Gli1蛋白表达水平均较对照组明显降低，差异均有统计学意义（t=7.44、5.94，均P=0.000）。

3 讨论

SCLC是肺癌的一个未分化癌分型，在肺癌中所占的比例约15%～20%，SCLC分为局限期和广泛期，大多数SCLC诊断时已为广泛期，局限期最多占1/3。小细胞肺癌的细胞倍增时间短，进展快，常伴内分泌异常或类癌综合征，早期即发生血行转移，可手术的患者仅占全部患者的5%，故SCLC的治疗以全身化疗为主。尽管新药不断涌现，但并没有明显改善SCLC的预后。靶向治疗近年来不断地改写NSCLC的临床治疗策略，但令人失望的是SCLC的靶向治疗至今尚无突破。

姜黄素刺猬信号通路是一条高度保守的信号传导通路，主要由信号分子刺猬、Ptch、Smo和下游的核转录因子Gli组成。Gli的靶基因涉及到肿瘤细胞的生长、凋亡、转移、上皮间质转化、新生血管形成等多个方面[6]。近年来的研究表明，刺猬或Gli信号通路在SCLC中常持续异常活化，在SCLC的发生、发展过程中起重要作用[7]。

姜黄素因具有预防肿瘤、抑制肿瘤、放化疗增敏等多种作用，近年来在肿瘤领域受到极大关注。研究表明，姜黄素对多种肿瘤细胞，包括乳腺癌、胃癌、大肠癌、肺癌、胰腺癌等均具有化学预防及治疗作用[8-9]。姜黄素抗肿瘤作用的机制主要是通过调节多条信号通路分子，如下调EGFR、HER-2、Wnt/β-catenin及其下游信号分子ERK、AKT、NF-κB、STATs等，上调p21、p27、细胞周期激酶抑制剂等[10-13]。

我们研究了姜黄素对SCLC细胞NCI-H446的增殖抑制及诱导凋亡作用。结果发现，不同浓度的姜黄素与SCLC细胞NCI-H446共培养后，随着姜黄素浓度的逐渐增加，NCI-H446细胞的增殖抑制也逐渐增加，浓度为15μmol/L的姜黄素可明显抑制NCI-H446细胞的增殖。NCI-H446细胞经姜黄素处理后，细胞凋亡率明显高于对照组。这提示姜黄素可在体外诱导NCI-H446细胞凋亡，抑制细胞增殖。本研究发现，经姜黄素处理后，NCI-H446细胞Shh和Gli1的表达水平明显下降。Gli蛋白是Smo下游的转录因子，在刺猬通路中起关键作用。Gli1也是刺猬信号活化后的靶基因，Gli1表达下降，提示刺猬信号通路被抑制。

本研究结果提示，姜黄素能抑制SCLC细胞NCIH446的体外增殖，并可能通过抑制细胞刺猬信号通路的信号分子Shh、Gli1表达诱导NCI-H446细胞的凋亡。姜黄素作用48h后，NCI-H446细胞中的Shh、Gli1蛋白表达水平均降低，这些结果提示姜黄素可抑制刺猬信号分子的活化。

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Curcumin induces apoptosis of small cell lung cancer cells by inhibiting Hedgehog signaling pathway

Objective To investigate the effects of curcumin on small cell lung cancer cells and the possible molecular mechanisms．Methods The cultured small cell lung cancer NCI-H446 cells were treated with concentrations of curcumin,the cell proliferation was measured by MTT assay,apoptosis was detected by flow cytometery,the expressive level of Shh and GLI1 were detected by Western blot．Results Curcumin(15μmol/L)significantly inhibited the growth of NCI-H446 cells(P＜0．01)and induced cell apoptosis(P＜0．01)．The expressive levels of Shh and GLI1 in curcumin treated groups were significantly reduced compared to those in control group(P＜0．01)．Conclusion Curcumin can inhibit proliferation and induce apoptosis of small cell lung cancer cells by inhibiting Hedgehog signaling pathways．

Curcumin Small cell lung cancer Hedgehog

2012-08-27）

（本文编辑：杨丽）

310013 杭州，浙江医院肿瘤科